參松養(yǎng)心膠囊對心室肌細胞鉀通道的影響

編者按 細胞膜離子通道結構異常、功能失調(diào)是產(chǎn)生心律失常的關鍵原因。目前的4類抗心律失常西藥：鈉、鈣離子通道阻滯劑，β受體阻滯劑和動作電位延時藥（以鉀通道阻滯劑為主）中，有的品種因具有抗心律失常藥的致心律失常副作用，尤其是導致尖端扭轉性心律失常可致患者死亡率升高，加之其遠期療效不佳，這構成了抗心律失常藥物臨床應用和研發(fā)的瓶頸。只有能夠改善離子通道紊亂并恢復其正常生理功能的藥物，才能阻止心律失常的發(fā)生并提高遠期療效。

為此，阜外心血管病醫(yī)院浦介麟教授等以膜片鉗技術為核心，對心肌細胞離子通道蛋白的結構、功能及其與心律失常發(fā)生的關系進行了深入研究，并在參松養(yǎng)心膠囊對心室肌細胞鉀通道影響的最新研究中，探討了其治療心律失常的細胞電生理學作用機制。他們的系列研究在第二屆國際絡病學大會上進行了報告。其研究結果證實，參松養(yǎng)心膠囊干粉提取溶液對豚鼠單個心室肌細胞內(nèi)向整流鉀電流(IKI)、瞬時外向鉀電流（Ito）以及豚鼠心肌細胞延遲整流鉀電流（IK）均具有不同程度的阻滯作用。他們繼對L 型鈣離子通道電流(ICa L)、鈉離子通道電流(INa)的研究之后，再次揭示:參松養(yǎng)心膠囊的抗心律失常作用可能是通過對心肌細胞離子通道的影響來實現(xiàn)的。

摘要

目的 觀察參松養(yǎng)心膠囊干粉提取溶液對單個大鼠心室肌細胞內(nèi)向整流鉀電流(IKI)、瞬時外向鉀電流（Ito）以及豚鼠心肌細胞延遲整流鉀電流（IK）的影響。

方法 用酶解法分離單個心室肌細胞，并用全細胞膜片鉗技術記錄鉀通道電流。

結果 當藥物濃度為0.5%時,可以使大鼠心肌細胞IKI內(nèi)向成分降低，使 －100mV時IKI電流密度從(-10.78±1.80)pA/pF降至(-7.18±2.05)pA/pF，平均抑制率為（33.1±16.85）%(n=11,P<0.05)，但不改變電流的翻轉電位及整流特性。藥物同時對Ito電流的瞬時成分有抑制作用，當60mV時,Ito電流密度從(-17.13±8.04)pA/pF降至(-7.74±4.76)pA/pF，平均抑制率為（50.60±10.77）%(n=6,P<0.05)，穩(wěn)態(tài)失活曲線左移，失活后恢復時間常數(shù)增大。當藥物濃度為0.5%時，對IK有電壓依賴性抑制作用，當50mV時對尾電流峰值的抑制率為（30.77±1.11）%(n=5，P<0.05)。

結論 參松養(yǎng)心膠囊干粉提取溶液對IKI、Ito和IK均具有不同程度的阻滯作用,這可能是其抗心律失常藥理機制的一部分。

參松養(yǎng)心膠囊是由十幾種中藥組成的復方制劑，方中多數(shù)藥物均有較好的抗心律失常作用。動物模型研究報告顯示，參松養(yǎng)心膠囊能明顯抑制藥物誘發(fā)的心律失常，并對缺血再灌注所致心律失常有明顯的保護作用。曾有隨機雙盲臨床試驗顯示，參松養(yǎng)心膠囊對治療冠心病心律失常有明顯療效。但未見其對心肌細胞離子通道影響的報告。鉀離子通道是影響細胞膜復極的重要通道，本研究采用全細胞膜片鉗記錄技術，探討參松養(yǎng)心膠囊對大鼠單個心室肌細胞鉀離子通道IKI、Ito的影響，了解其藥理作用的電生理機制，為其臨床應用進一步提供理論和實驗依據(jù)。

材料和方法

材料

1.試劑 參松養(yǎng)心膠囊提取干粉，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。Ⅱ型膠原酶(collagenase Ⅱ)為Gibico 公司產(chǎn)品。鏈蛋白酶E為Merck公司產(chǎn)品。N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、乙二醇-雙四乙酸(EGTA)、谷氨酸(L-Glutamic acid)、牛磺酸(Taurine)、天門冬氨酸、磷酸肌酸二鈉、氯化膽堿(Choline-Cl，ChCl)、氯化鈣（CaCl2）、K2ATP為Sigma公司產(chǎn)品。4-氨基吡啶(4-AP)為Fluka公司產(chǎn)品。其余試劑為國產(chǎn)分析純，由北京化學試劑公司提供。

2.溶液 ①無鈣臺氏液(mmol/L)：NaCl136、KCl5.4、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES10、Glucose10，用NaOH調(diào)pH至7.4。②KB液(mmol/L)：KCl40、KH2PO420、MgSO43.0、KOH80、L-谷氨酸50、牛磺酸20、HEPES10、Glucose10、EGTA0.5，用KOH調(diào)pH至7.4。③記錄全細胞鉀電流的灌流液(mmol/L)：Choline-Cl136、MgCl21.2、KCl5.4、NaH2PO40.33、CaCl21.8,CdCl20.15,HEPES10、Glucose10，用LiOH調(diào)pH至7.4。記錄IK時加1mmol/L BaCl2以阻斷IKI電流。④記錄全細胞鉀電流的電極內(nèi)液(mmol/L)：天門冬氨酸鉀120、KCl20、HEPES5、MgCl21.0、K2ATP4、EGTA10、磷酸肌酸二鈉2，用KOH調(diào)pH至7.3。所用電極內(nèi)液均經(jīng)過直徑0.22μm微孔濾膜過濾。⑤參松養(yǎng)心膠囊藥物溶液的配制：將參松養(yǎng)心膠囊提取干粉，先用無KCl的細胞外灌流液配制成質(zhì)量濃度0.5％溶液，再調(diào)整K+濃度至5.4mmol/L,離心取上層溶液備用。

3.動物 雄性SD大鼠，體重250～300g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

方法

1.單個心肌細胞的分離

參考文獻并加以改進，用急性酶解法制備心室肌單個細胞。取大鼠用50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，開胸取出心臟，在4℃無鈣Tyrode液中去除脂肪和心包膜，分離主動脈并插管，行Langendorff心臟灌流（圖1），速度為6～8ml/min。先以無鈣臺氏液灌流3分鐘（灌注壓為20cm水柱），洗凈冠脈內(nèi)血液，再用低鈣酶解液（CaCl2為0.05mmol/L低鈣臺氏液,含Ⅱ型膠原酶0.4mg/ml，鏈蛋白酶E0.04mg/ml）循環(huán)灌流，大約20分鐘后，將心臟從Langendorff裝置上取下，置入室溫KB液中，剪去心房和基底部的組織，持眼科鑷將心室組織輕輕撕拉，用粗開口的吸管緩慢吹打，使心肌細胞從心肌組織上脫離，獲得單個心室肌細胞,上清液用120目的尼龍過濾網(wǎng)過濾，心肌細胞收藏在含KB液的試管中。整個灌流系統(tǒng)溫度保持在37℃，所有的灌流液和KB液均通以100%的O2飽和30分鐘以上。將細胞在室溫下靜置半小時左右復鈣至0.25mmol/L，室溫保存?zhèn)溆?。豚鼠心肌細胞的分離方法基本相同。

2.全細胞膜片鉗實驗記錄

實驗前吸取少許富含細胞的KB懸液于0.5ml的灌流槽中，靜置5～10分鐘，待細胞沉底附壁后，用100%O2飽和的細胞外液 實驗前吸取少許富含細胞的KB懸液于0.5ml的灌流槽中，靜置5～10分鐘，待細胞沉底附壁后，用100%O2飽和的細胞外液進行表面灌流5～10分鐘，流速約2ml/分鐘。在倒置顯微鏡(OLYMPUS1×70)下選擇邊緣清楚、表面光滑、橫紋清晰、無收縮的細胞。實驗在22～24℃室溫下進行。采用Hamill 等人的標準全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制模式下記錄通道電流。膜片鉗放大器(Axopatch700B，美國Axon公司)，通過A/D和D/A數(shù)據(jù)轉換器（Digidata1322，美國Axon公司）同計算機相連接。刺激信號及電壓、電流輸入信號的采集均由軟件(pClampex10.0，美國Axon公司)控制。玻璃毛胚管(中國科學院物理所提供)經(jīng)微電極拉制儀(p-97，美國Sutter公司)進行4步拉制而成，經(jīng)拋光儀(MF-830，日本Narishige公司)拋光后尖端直徑2～3μm。充灌電極內(nèi)液后入水電阻為1.5～3MΩ，補償液接電位后，調(diào)節(jié)三維操縱器(MHW-3，日本NARISHIGE公司)使電極尖端移向細胞表面，形成高阻封接(giga seal)，封接電阻為1GΩ以上。補償快電容并吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。電容測定時給予－10mV躍階的刺激，采用Cm=τ·Iss/△V求膜電容。調(diào)節(jié)慢電容補償和串聯(lián)電阻補償80%～90%以減少瞬時充放電電流和鉗位誤差。信號經(jīng)截止頻率為1kHz的4階貝塞爾低通濾波器，采樣率為10kHz。

在記錄時，為避免電流衰減（run down）現(xiàn)象的影響，電極內(nèi)液中加入ATP，并控制實驗在細胞破膜后25分鐘內(nèi)完成。根據(jù)實驗設計，將配制好的藥物溶液，用恒流蠕動泵以2ml/分鐘速度向細胞灌流槽分別灌流，同時使用整負壓吸引裝置將廢液從灌流槽中吸除。記錄方法為破膜后穩(wěn)定5分鐘記錄給藥前的電流值，給藥5分鐘后記錄藥物作用下的電流值。采樣后數(shù)據(jù)存貯在電腦硬盤內(nèi)，供測量及分析用。為消除細胞間誤差，電流值以電流密度(pA/pF)表示。

3.各電流刺激方案設定及觀察指標

記錄IKI時刺激方案 維持電位(Vh)-40mV，指令電位-120mV~0mV,躍階10mV,鉗制時間400ms,刺激頻率0.2Hz。以測試電壓-100mV的IKI穩(wěn)態(tài)電流密度在用藥前后的變化作為觀察指標。

記錄Ito電流電壓關系時刺激方案

維持電位(Vh)-90mV，先給予－40mV20ms前刺激，再給予-40mV~+60mV去極化刺激,躍階10mV,鉗制時間400ms,刺激頻率0.2Hz。以測試電壓60mV Ito峰值電流密度在用藥前后的變化作為觀察指標。

記錄Ito穩(wěn)態(tài)失活的刺激方案 維持電壓－90mV,給予400ms從－120mV～60mV躍階10mV的前刺激，然后鉗制在60mV300ms記錄Ito電流，并比較用藥前后的變化。