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放射免疫分析的基本原理是標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）的競爭結合反應。它的反應式為：
在這一反應系統(tǒng)中，作為試劑的標記抗原和抗體的量是固定的?？贵w的量一般取用能結合40％～50％的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的。根據標本中抗原量的不同，得到不同的反應結果。
假設受檢標本中不含抗原時的反應條件為：
4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*）（2）
在標本中存在抗原時，舉例如下：
4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→
1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）（3）
當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時存在于一個反應系統(tǒng)時，由于標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結合力，因此兩者相互競爭結合特異性抗體。由于標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體復合物形成的量就隨著非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應地結合較多的抗體，從而抑制標記抗原對抗體的結合，使標記抗原抗體復合物相應減少，游離的標記抗原相應增加，亦即抗原抗體復合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比（圖16-1）。若將抗原抗體復合物與游離標記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可算性結合態(tài)的標記抗原（B）與游離態(tài)的標記抗原（F）的比值（B/F），或算出其結合率[B/(B＋F)]，這與標本中的抗量呈函數(shù)關系。用一系列不同劑量的標準抗原進行反應，計算相應的B/F，可以繪制出一條劑量反應曲線（圖16-2）。受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線上查出標本中抗原的含量。
圖16-1 放射免疫分析原理示意圖
圖16-2 劑量反應曲線
（一）標記物
標記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要為131I、125I、57Cr和60Co；后者有14C、3H和32P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。例如125I比活性的理論值是64.38×104GBq/g（1.74×104Ci/g），有較長半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g（4.5Ci/g）。兩者相比，1mol125I或14C結合到抗原上，125I的敏感度約比14C大3900倍。又因為125I有合適的半衰期，低能量的γ射線易于標記，因而125I是目前常用的RIA標記物。
（二）標記方法
標記125I的方法可分兩大類，即直接標記法和間接標記法。
直接標記法是將125I直接結合于蛋白質側鏈殘基的酪氨酸上。此法優(yōu)點是操作簡便，為125I和蛋白質的單一步驟的結合反應，它能使較多的125I結合在蛋白質上，故標記物具有高度比放射性。但此法只能用于標記含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的殘基如具有蛋白質的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。
間接標記法（又稱連接法）是以125I標記在載體上，純化后再與蛋白質結合。由于操作較復雜，標記蛋白質的比放射性顯著低于直接法。但此法可標記缺乏酪氨酸的肽類及某些蛋白質。如直接法標記引起蛋白質酪氨酸結構改變而損傷其免疫及生物活性時，也可采用間接法。它的標記反應較為溫和，可以避免因蛋白質直接加入125I液引起的生物活性的喪失。下面介紹最常用的氯胺T直接標記法。
氯胺T是對甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5），氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。反應式如下：
放射性碘標記率的高低與抗原（蛋白質或多肽）分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有關，當分子中含有較多的酪氨酸，又暴露在外時，則標記率就高。
標記方法：將純化抗原和125I加入小試管底部，然后將新鮮配制的氯胺T快速沖入，混勻振蕩數(shù)十秒～2min后加入偏重亞硫酸鈉終止反應。再加入KI溶液稀釋。然后在葡聚糖G柱上分離，逐管收集。分別用井型閃爍計數(shù)器測定放射性強度（脈沖數(shù)/min,cpm），前部為標記抗原峰，后部為游離125I峰。在標記抗原峰試管內加等量1％白蛋白作穩(wěn)定劑，此即為標記抗原液。
（三）標記物的鑒定
1．放射性游離碘的含量用三氯醋酸（預先在受鑒定樣品中加入牛血清白蛋白）將所有蛋白質沉淀，分別測定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游離碘在總放射性碘的5％以下。標記抗原在貯存過久后，會出現(xiàn)標記物的脫碘，如游離碘超過5％則應重新純化去除這部分游離碘。
2．免疫活性標記時總有部分抗原活性損失，但應盡量避免。檢查方法是用小量的標記抗原加過量的抗體，反應后分離B和F，分別測定放射性，算出BT％。此值應在80％以上，該值越大，表示抗原損傷越少。
3．放射性比度標記抗原必須有足夠的放射性比度。比度或比放射性是指單位重量抗原的放射強度。標記抗原的比放射性用mCi/mg（或mCi/mmol）表示。比度越高，測定越敏感。標記抗原的比度計算是根據放射性碘的利用率（或標記率）：
如：5μghGH用2mCiNa125I進行標記，標記率為40％，則
（四）抗血清的檢定
含有特異性抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑，常以抗原免疫小動物誘發(fā)產生多克隆抗體而得?？寡宓馁|量直接影響分析的靈敏度和特異性。抗血清質量的指標主要有親和常數(shù)、交叉反應率和滴度。
1．親和常數(shù)親和常數(shù)（affinityconstant）常用K值表示。它反映抗體與相應抗原的結合能力。K值的單位為mol/L，即表示1mol抗體稀釋至若干L溶液中時，與相應的抗原結合率達到50％?？寡錕值越大，放射免疫分析的靈敏度、精密和準確度越佳?？寡宓腒值達到109～1012mol/L才適合用于放射免疫分析。
2．交叉反應率放射免疫分析測定的物質有些具有極為類似的結構，例如甲狀腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。針對一種抗原的抗血清往往對于其類似物會發(fā)生交叉反應。因此交叉反應率反映抗血清的特異性，交叉反應率過大將影響分析方法的準確性。交叉反應率的測定方法為用與抗血清相應抗原及其類似物用同法進行測定，觀察置換零標準管50％時的量。以T3抗血清為例，置換零標準50％T3為1ng，其類似物T4則需200ng，則其交叉反應率為：1/200＝0.5％。
3．滴度滴度系指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。在放射免疫分析中滴度為在無受檢抗原存在時，結合50％標記抗原時抗血清的稀釋度。
《脾胃論》（公元 1249 年）金．李杲（東垣、明之）著。三卷。依據臨床實踐，結合醫(yī)學理論，認為脾胃在人體生理活動中最為 重要，提出“內傷脾胃，百病由生”的主張。
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放射免疫分析的基本原理是標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）的競爭結合反應。它的反應式為：
在這一反應系統(tǒng)中，作為試劑的標記抗原和抗體的量是固定的?？贵w的量一般取用能結合40％～50％的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的。根據標本中抗原量的不同，得到不同的反應結果。
假設受檢標本中不含抗原時的反應條件為：
4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*）（2）
在標本中存在抗原時，舉例如下：
4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→
1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）（3）
當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時存在于一個反應系統(tǒng)時，由于標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結合力，因此兩者相互競爭結合特異性抗體。由于標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體復合物形成的量就隨著非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應地結合較多的抗體，從而抑制標記抗原對抗體的結合，使標記抗原抗體復合物相應減少，游離的標記抗原相應增加，亦即抗原抗體復合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比（圖16-1）。若將抗原抗體復合物與游離標記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可算性結合態(tài)的標記抗原（B）與游離態(tài)的標記抗原（F）的比值（B/F），或算出其結合率[B/(B＋F)]，這與標本中的抗量呈函數(shù)關系。用一系列不同劑量的標準抗原進行反應，計算相應的B/F，可以繪制出一條劑量反應曲線（圖16-2）。受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線上查出標本中抗原的含量。
圖16-1 放射免疫分析原理示意圖
圖16-2 劑量反應曲線
（一）標記物
標記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要為131I、125I、57Cr和60Co；后者有14C、3H和32P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。例如125I比活性的理論值是64.38×104GBq/g（1.74×104Ci/g），有較長半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g（4.5Ci/g）。兩者相比，1mol125I或14C結合到抗原上，125I的敏感度約比14C大3900倍。又因為125I有合適的半衰期，低能量的γ射線易于標記，因而125I是目前常用的RIA標記物。
（二）標記方法
標記125I的方法可分兩大類，即直接標記法和間接標記法。
直接標記法是將125I直接結合于蛋白質側鏈殘基的酪氨酸上。此法優(yōu)點是操作簡便，為125I和蛋白質的單一步驟的結合反應，它能使較多的125I結合在蛋白質上，故標記物具有高度比放射性。但此法只能用于標記含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的殘基如具有蛋白質的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。
間接標記法（又稱連接法）是以125I標記在載體上，純化后再與蛋白質結合。由于操作較復雜，標記蛋白質的比放射性顯著低于直接法。但此法可標記缺乏酪氨酸的肽類及某些蛋白質。如直接法標記引起蛋白質酪氨酸結構改變而損傷其免疫及生物活性時，也可采用間接法。它的標記反應較為溫和，可以避免因蛋白質直接加入125I液引起的生物活性的喪失。下面介紹最常用的氯胺T直接標記法。
氯胺T是對甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5），氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。反應式如下：
放射性碘標記率的高低與抗原（蛋白質或多肽）分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有關，當分子中含有較多的酪氨酸，又暴露在外時，則標記率就高。
標記方法：將純化抗原和125I加入小試管底部，然后將新鮮配制的氯胺T快速沖入，混勻振蕩數(shù)十秒～2min后加入偏重亞硫酸鈉終止反應。再加入KI溶液稀釋。然后在葡聚糖G柱上分離，逐管收集。分別用井型閃爍計數(shù)器測定放射性強度（脈沖數(shù)/min,cpm），前部為標記抗原峰，后部為游離125I峰。在標記抗原峰試管內加等量1％白蛋白作穩(wěn)定劑，此即為標記抗原液。
（三）標記物的鑒定
1．放射性游離碘的含量用三氯醋酸（預先在受鑒定樣品中加入牛血清白蛋白）將所有蛋白質沉淀，分別測定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游離碘在總放射性碘的5％以下。標記抗原在貯存過久后，會出現(xiàn)標記物的脫碘，如游離碘超過5％則應重新純化去除這部分游離碘。
2．免疫活性標記時總有部分抗原活性損失，但應盡量避免。檢查方法是用小量的標記抗原加過量的抗體，反應后分離B和F，分別測定放射性，算出BT％。此值應在80％以上，該值越大，表示抗原損傷越少。
3．放射性比度標記抗原必須有足夠的放射性比度。比度或比放射性是指單位重量抗原的放射強度。標記抗原的比放射性用mCi/mg（或mCi/mmol）表示。比度越高，測定越敏感。標記抗原的比度計算是根據放射性碘的利用率（或標記率）：
如：5μghGH用2mCiNa125I進行標記，標記率為40％，則
（四）抗血清的檢定
含有特異性抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑，常以抗原免疫小動物誘發(fā)產生多克隆抗體而得?？寡宓馁|量直接影響分析的靈敏度和特異性。抗血清質量的指標主要有親和常數(shù)、交叉反應率和滴度。
1．親和常數(shù)親和常數(shù)（affinityconstant）常用K值表示。它反映抗體與相應抗原的結合能力。K值的單位為mol/L，即表示1mol抗體稀釋至若干L溶液中時，與相應的抗原結合率達到50％?？寡錕值越大，放射免疫分析的靈敏度、精密和準確度越佳?？寡宓腒值達到109～1012mol/L才適合用于放射免疫分析。
2．交叉反應率放射免疫分析測定的物質有些具有極為類似的結構，例如甲狀腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。針對一種抗原的抗血清往往對于其類似物會發(fā)生交叉反應。因此交叉反應率反映抗血清的特異性，交叉反應率過大將影響分析方法的準確性。交叉反應率的測定方法為用與抗血清相應抗原及其類似物用同法進行測定，觀察置換零標準管50％時的量。以T3抗血清為例，置換零標準50％T3為1ng，其類似物T4則需200ng，則其交叉反應率為：1/200＝0.5％。
3．滴度滴度系指將血清稀釋時能與抗原發(fā)生反應的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。在放射免疫分析中滴度為在無受檢抗原存在時，結合50％標記抗原時抗血清的稀釋度。