《免疫學和免疫學檢驗》 二、測定方法

用放射免疫分析進行測定時分三個步驟，即抗原抗體的競爭抑制反應(yīng)、B和F的分離及放射性的測量。

（一）抗原抗體反應(yīng)

將抗原（標準品和受檢標本）、標記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進行反應(yīng)一定時間，使競爭抑制反應(yīng)達到平衡。不同質(zhì)量的抗體和不同含量的抗原對溫育的溫度和時間有不同的要求。如受檢標本抗原含量較高，抗血清的親和常數(shù)較大，可選擇較高的溫度（15～37℃）進行較短時間的溫育，反之應(yīng)在低溫（4℃）作較長時間的溫育，形成的抗原抗體復合物較為牢固。

（二）B、F分離技術(shù)

在RIA反應(yīng)中，標記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標記抗原抗體復合物（B）不能自行沉淀，因此需用一種合適的沉淀劑使它徹底沉淀，以完成與游離標記抗原（F）的分離。另外對小分子量的抗原也可采取吸附法使B與F分離。

1．第二抗體沉淀法這是RIA中最常用的一種沉淀方法。將產(chǎn)生特異性抗體（第一抗體）的動物（例如兔）的IgG免疫另一種動物（例如羊），制得羊抗兔IgG血清（第二抗體）。由于在本反應(yīng)系統(tǒng)中采用第一、第二兩種抗體，故稱為雙抗體法。在抗原與特異性抗體反應(yīng)后加入第二抗體，形成由抗原－第一抗體－第二抗體組成的雙抗體復合物。但因第一抗體濃度甚低，其復合物亦極少，無法進行離心分離，為此在分離時加入一定量的與一抗同種動物的血清或IgG，使之與第二抗體形成可見的沉淀物，與上述抗原的雙抗體復合物形成共沉淀。經(jīng)離心即可使含有結(jié)合態(tài)抗原（B）的沉淀物沉淀，與上清液中的游離標記抗原（F）分離。

將第二抗體結(jié)合在顆粒狀的固相載體之上即成為固相第二抗體。利用固相第二抗體分離B、F，操作簡便、快速。

2．聚乙二醇（PEG）沉淀法最近各種RIA反應(yīng)系統(tǒng)逐漸采用了PEG溶液代替第二抗體作沉淀劑。PEG沉淀劑的主要優(yōu)點是制備方便，沉淀完全。缺點是非常特異性結(jié)合率比用第二抗體為高，且溫度高于30℃時沉淀物容易復溶。

3．PR試劑法是一種將雙抗體與PEG二法相結(jié)合的方法。此法保持了兩者的優(yōu)點，節(jié)省了兩者的用量，而且分離快速、簡便。

4．活性炭吸附法小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子復合物留在溶液中。如在活性炭表面涂上一層葡聚糖，使它表面具有一定孔徑的網(wǎng)眼，效果更好。在抗原與特異性抗體反應(yīng)后，加入葡聚糖－活性炭。放置5～10min，使游離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉淀，上清液中含有結(jié)合的標記抗原。此法適用于測定類固醇激素，強心糖苷和各種藥物，因為它們是相對非極性的，又比抗原抗體復合物小，易被活性炭吸附。

（三）放射性強度的測定

B、F分離后，即可進行放射性強度測定。測量儀器有兩類，液體閃爍計數(shù)儀（β射線，如3H、32P、14C等）和晶體閃爍計數(shù)儀（β射線，如125、131I、57Cr等）。

計數(shù)單位是探測器輸出的電脈沖數(shù)，單位為cpm（計數(shù)/分），也可用cps（計數(shù)/秒）表示。如果知道這個測量系統(tǒng)的效率，還可算出放射源的強度，即dpm（衰變/分）或dps（衰變/秒）。

每次測定均需作標準曲線圖，以標準抗原的不同濃度為橫坐標，以在測定中得到的相應(yīng)放射性強度為縱坐標作圖（圖16-3）。放射性強度可任選B或F，亦可用計算值B/(B＋F)、B/F和B/B。標本應(yīng)作雙份測定，取其平均值，在制作的標準曲線圖上查出相應(yīng)的受檢抗原濃度。

圖16-3 放射免疫分析標準曲線示例