《中國幽門螺桿菌研究》 雙特異抗體酶免疫染色法檢測幽門螺桿菌抗體

自從1983年Warren和Marshall從人胃粘膜成功地分離出幽門螺桿菌（Hp）后，已有越來越多的實(shí)驗結(jié)果表明Hp與慢性胃和潰瘍病有密切關(guān)系，可能是這些疾病的致病因素之一。目前診斷Hp的方法主要有組織培養(yǎng)法、尿素酶試驗和各種染色法。鑒于這些方法繁瑣、費(fèi)時、須胃鏡取材才能完成等，尋找一種敏感性高、特異性好、快速且簡便的診斷Hp的方法，是目前急需研究和解決的問題。本文報道建立一種新的免疫酶技術(shù)—“雙特異抗體”酶免疫染色法，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　材料和方法

1.1　材料

①試劑：辣根過氧化物酶（HRP），R2≈3.0，系中科院上海生化研究所產(chǎn)品。底物：3.3'二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸（DAB－4HCI），瑞士產(chǎn)品。②“雙特異抗體”的制備：人血清IgG的提純按飽和硫酸銨四步鹽析法進(jìn)行。雙抗原的制備按改良過碘酸鹽法，用HRP標(biāo)記純化的人IgG，制成免疫用的雙抗原。動物免疫。動物：體重分別為2.5kg和3.0kg的雄性家兔2只。免疫：初次免疫是將含HRP20mg，IgG5mg的雙抗原加等體積的福氏不完全佐劑多點(diǎn)、多部位注射于每只家兔的四肢。間隔1月后用原劑量的雙抗原加福氏不完全佐劑以同樣方式進(jìn)行第二次免疫。3周后用加倍的雙抗原經(jīng)耳靜脈注射。7d后試血，當(dāng)兔抗人IgG抗體和抗HRP抗體效價達(dá)1：32以上時頸動脈放血，分離血清－20℃保存。將雙抗血清與人IgG和HRP同時做雙擴(kuò)散試驗。瓊脂免疫雙擴(kuò)散第1孔為雙抗血清，第2孔為人IgG、第3孔為HRP，形成2條相互交叉的沉淀線。顯示雙抗血清與人IgG和HRP形成兩條相互交叉的沉淀線。③Hp菌液的制備：將NCTC11638Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株（由澳大利亞皇家佩思醫(yī)院惠贈）和本院胃鏡檢查鉗取患者胃粘膜分離培養(yǎng)獲得的25株Hp菌株分別接種于心腦血平板培養(yǎng)基上，37℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)3d～5d后進(jìn)行生化學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定，傳代培養(yǎng)后刮下菌苔制成菌液，以2‰甲醛固定，離心沉淀洗滌3次后測濃度。預(yù)實(shí)驗使用標(biāo)準(zhǔn)菌液，正式實(shí)驗采用混合菌液。④被檢血清：隨機(jī)抽取我院1988年胃鏡檢查患者的靜脈血，分離血清低溫保存。同時鉗取胃粘膜做尿素酶試驗（HpUT）、組織培養(yǎng)和病理查。

1.2　方法

將待測血清用生理鹽水稀釋成1：200滴于已固定Hp菌的玻片上，37℃溫育30min，漂洗、風(fēng)干。再加“雙特異抗體”和HRP各一環(huán)，同上溫育、洗滌后，加新配制的DAB一環(huán)，溫育10min后漂洗、風(fēng)干、油鏡下觀察結(jié)果。同時設(shè)陰性血清、PBS和正常兔血清對照。結(jié)果判斷：根據(jù)菌體著色程度和是否膨大記以＋～+++?！埃薄w染色呈灰黃色，“++”—菌體呈黃色并膨大，“+++”—菌體膨大并呈黃褐色，“++++”菌體呈深褐色而膨大。當(dāng)蓖體染色為“++”以上時為陽性。

2　結(jié)果

2.1　雙特異抗體酶免疫染色法（bispecificantibody　enzymatic immunostaining，BSABEIS）的建立

按方陣滴定法進(jìn)行。將1.8×109/ml的Hp菌液一環(huán)固定玻片，再加1：2比稀釋至1：128的陽性血清，溫育洗滌后加1：2至1：64倍經(jīng)稀釋的“雙特異抗體”和HRP（0.01mg/ml），同上溫育洗滌后加底物液，10min后觀察結(jié)果（表1）。表1所示，當(dāng)陽性血清在1：64稀釋的血清和1：16“雙特異抗體”作為工作濃度。固定抗原（1.8×109/ml）和陽性血清（1：64）的濃度，將雙抗按1：2至1：64倍比稀釋，HRP從0.32mg/ml倍比稀釋至0.005mg/ml，按以上步驟和條件進(jìn)行染色，結(jié)果見表2。表2顯示，HRP在0.005mg/ml，雙抗在1：16以上時，均呈“+++”的陽性結(jié)果，為保證實(shí)驗的準(zhǔn)確性，正式實(shí)驗選用0.01mg/mlHRP和1：16雙抗作為工作濃度。

表1　陽性血清和雙特異抗體最適濃度選擇

雙特異抗體不同濃度待測陽性血清染色鏡檢結(jié)果對照1：21：41：81：161：321：641：128陰性血清PBS1：2++++++++++++++++++++++－－1：4++++++++++++++++++++++－－1：8+++++++++++++++++++++－－1：16+++++++++++++++++++++－－1：32++++++++++++++++++++－－1：64++++++++－＋±－－

表2　雙特異抗體和HRP最適濃度選擇

雙特異抗體不同濃度HRP（mg/ml）染色鏡檢結(jié)果對照0.320.160.080.040.020.010.005陰性血清PBS1：2++++++++++++++++++++++++++++－－1：4++++++++++++++++++++++++++++－－1：8+++++++++++++++++++++++++－－1：16++++++++++++++++++++++++++－－1：32++++++++++++＋＋－－1：64±±±－－－－－－

特異性試驗　分別用20億/ml的Hp、霍亂弧菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、白色念珠菌、福氏痢疾桿菌、宋氏痢疾桿菌、副傷寒桿菌甲、副傷寒桿菌乙、不凝集弧菌和空腸彎曲菌制成涂片標(biāo)本，依次加Hp陽性血清、雙抗體、HRP和底物染色后鏡檢、同時設(shè)陰性血清、PBS和正常兔血清對照。結(jié)果顯示，除Hp呈+++的陽性染色外，其余細(xì)菌染色均呈陰性、對照組也均未著色。

敏感性試驗　選擇6份Hp陽性血清，按上述方法染色，同時與試管凝集試驗和顯微凝集試驗進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，本法測得抗體效價＞1280，顯著高于試愛凝集（1：320）。

2.2　BSABEIS法的臨床應(yīng)用

用本法檢測100例慢性胃炎和潰瘍病患者血清，同時與培養(yǎng)法Hp和尿素酶試驗HpUT進(jìn)行對比（表3）。結(jié)果顯示，本法陽性率（71％）高于HpC法（59％）和HpUT法（62％），但無顯著性差異（P＞0.05）。三種檢測方法檢測結(jié)果符合率比較結(jié)果見表4～5。BSABEIS法與HpC法和HpUT法的總符合率分別是62％和61％。

表3　BSABEIS法與其它二種方法對比（n：100）

方法檢測結(jié)果陽性數(shù)陰性數(shù)陽性率（％）BSABEIS100712971HpC100594159HpUT100623862

表4　BSABEIS法與HpC法比較（n：100）

BSABEISHpC合計＋－＋462571－131629合計5941100

表5　BSABEIS 法與HpC法比較（n：100）

BSABEISHpUT合計＋－＋472471－151429合計6238100

3　討論

自NakaneAvrameas（1966）建立酶標(biāo)抗體技術(shù)用于定位抗原以來，已發(fā)展了許多免疫酶技術(shù)，可歸納為二大類，即標(biāo)記抗體和非標(biāo)記抗體免疫技術(shù)，后者避免了標(biāo)記過程中酶和抗體活性減弱及標(biāo)記與未標(biāo)記抗體間競爭干擾，從而提高敏感性和特異性。Steruberger等采用抗酶抗體法（PAP）檢測鉤端螺旋體，發(fā)現(xiàn)其錄敏度較熒光抗體法比高100～1000倍。Petrali等也發(fā)現(xiàn)了PAP法比抗體搭橋法靈敏5～20倍。Moriaty等實(shí)驗證實(shí)了PAP法優(yōu)于放射免疫法。最近Milstein制備一種既抗抗原雙抗酶的雙抗體，提高了檢測敏感性和特異性。本文建立的“雙特異抗體”酶免疫染色法就基于以上原則而制成既抗人IgG又抗HRP的“雙特異抗體”。經(jīng)臨床標(biāo)床檢測結(jié)果證實(shí)其所能測出的抗體滴度顯著高于顯微凝集法和試管凝集法（4～8倍），并與10種腸道菌均無交叉反應(yīng)。檢測Hp感染率高于培養(yǎng)法和尿素酶試驗，總符合率分別是62％和61％，但BSABEIS法71例陽性中HpC法和25例示檢出，HpUT法62例陽性中本法有15例未檢出，可能病人尚處于感染初期，抗體水達(dá)到檢出的水平。關(guān)于“雙特異抗體”的本質(zhì)有待進(jìn)一步闡明。