絡(luò)病與心腦血管疾病相關(guān)性及治療研究進(jìn)展

通心絡(luò)對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響(二)

4.結(jié)果的判定

BrdU標(biāo)記法 各組大鼠于處死前兩天即造模后第1、2天,第5、6天,第12、13天,第19、20天時分別腹腔注射BrdU生理鹽水液(sigma),按100mg/kg體重的量,每日給藥兩次,間隔8h。

腦組織切片制備 各組大鼠于末次腹腔注射BrdU后24h,在10%水合氯醛麻醉下,迅速斷頭取腦,放入特制的小盒內(nèi),緩緩平放入盛有液氮的小杯中,當(dāng)盒底接觸液氮時即開始?xì)饣序v,10~20min后腦組織迅速冰結(jié)成塊,取出腦組織冰塊立即置入恒溫箱切片機(jī)冷凍切片。參考《大鼠腦立體定向圖譜》,以前鹵后0.3~1.2mm為側(cè)腦室;前鹵后3.14~4.52mm為海馬區(qū)部位,連續(xù)冠狀切片,切片以0.1%多聚賴氨酸處理,每張腦片厚8μm,所得切片依次入4%多聚甲醛固定15min后,吹干,置4℃冰箱中備用。

BrdU與β-Tubulin、BrdU與GFAP免疫熒光雙標(biāo)染色法 分別取每只大鼠相鄰的SVZ、DG區(qū)腦片各8張,參考雞尾酒法按以下步驟行免疫熒光染色:將腦片入2mol/L HCL中30min(37℃);30.1M硼酸緩沖液(pH8.4)洗10min;0.2%H2O2放置30min;腦片上分別加入正常血清封閉液,即正常山羊血清、正常山羊血清+正常兔血清60min后甩去多余的血清,不以PBS沖洗;再分別加一抗:小鼠抗大鼠 BrdU IgG(1:50)和兔抗大鼠β-Tubulin IgG(1:100)或山羊抗大鼠 GFAP IgG(1:100)混和液,濕盒中4℃孵育72h。洗后再分別加二抗:山羊抗兔 IgG-TRITC(1:100)+山羊抗小鼠IgG-FITC(1:20),或兔抗山羊 IgG-TRITC(1:100)+山羊抗小鼠IgG-FITC(1:20),避光,濕盒中室溫孵育3h。磷酸緩沖液(PBS)沖洗兩次,緩甘油封片,避光保存,即送激光共聚焦顯微鏡下觀察。

各組另取兩張片為陰性對照,一張不加入一抗,另一張不加入二抗,余步驟同上。

上述各圖片在激光共聚焦顯微鏡統(tǒng)一放大倍數(shù)(10×20)下,設(shè)置相等的檢測窗口面積,隨機(jī)選10個陽性細(xì)胞區(qū)域,分別測其缺血側(cè)DG、SVZ區(qū)陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值并求均值,作為此張片的陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度值。

統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)輸入計算機(jī)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。檢測數(shù)據(jù)以x±s表示,作單因素方差分析和t 檢驗。

結(jié) 果

1.大鼠腦缺血再灌注后各時段活動情況

大鼠腦缺血再灌注后各個時間段活動較正常組減少,體重減輕。免疫組化雙標(biāo)圖片顯示,各時段對照組BrdU陽性細(xì)胞主要分布在缺血側(cè)皮質(zhì)、DG、SVZ、脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞等;部分BrdU陽性細(xì)胞同時呈β-Tubulin、GFAP染色陽性;隨缺血再灌注時間的延長,熒光強(qiáng)度值增加,其中造模后第7天大鼠DG區(qū)BrdU陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度值最高,與其他時間點相比,差異極顯著(P<0.001);第14天時SVZ、脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的BrdU陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度值最高,與其他時間點相比,差異極顯著(P<0.001);但造模后第21天時,BrdU陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度和BrdU+β-Tubulin、BrdU+GFAP免疫雙標(biāo)熒光強(qiáng)度值下降,但仍高于第3天時的強(qiáng)度值,差異顯著(P<0.005)。同時發(fā)現(xiàn),各時間段缺血側(cè)SVZ、脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞BrdU+GFAP免疫雙標(biāo)熒光強(qiáng)度值高于DG區(qū)的熒光強(qiáng)度值;而DG區(qū)的BrdU+β-Tubulin免疫雙標(biāo)熒光強(qiáng)度值高于SVZ、脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值,且均在第14天時強(qiáng)度最高。表明在海馬顆粒層和齒狀回增生的干細(xì)胞大部分分化為神經(jīng)元,而在SVZ、脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞增生的干細(xì)胞大部分分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。

2.通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠不同時間段NSC增殖分化的影響

實驗觀察到,給予通心絡(luò)干預(yù)后,第3天缺血側(cè)DG、SVZ的BrdU陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度值(表1)和BrdU+β-Tubulin(表2)、BrdU+GFAP免疫組化雙標(biāo)熒光強(qiáng)度值(表3)與模型對照組相比無顯著差異。通心絡(luò)干預(yù)后第7、14、21天時DG、SVZ的BrdU陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度值和BrdU+β-Tubulin、BrdU+GFAP免疫組化雙標(biāo)熒光強(qiáng)度值均高于缺血對照組,差異極顯著(P<0.001)。通心絡(luò)大劑量組第7、14、21天時熒光值均高于通心絡(luò)小劑量組,差異極顯著(P<0.001)。表明通心絡(luò)干預(yù)的第7天起,缺血側(cè)DG、SVZ神經(jīng)干細(xì)胞開始大量增殖,部分增殖細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞,并持續(xù)到缺血后第21天,而以通心絡(luò)大劑量組效果更為明顯。相關(guān)數(shù)據(jù)見表1、2、3,免疫組化檢測結(jié)果見圖1~4。