《生物化學(xué)與分子生物學(xué)》 （一）mRNA的加工修飾

原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為多順反子，即幾個(gè)結(jié)構(gòu)基因，利用共同的啟動(dòng)子和共同終止信號(hào)經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，所以此mRNA分子編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過酶和乙?；D(zhuǎn)移酶。原核生物中沒有核模，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過程。

真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為單順反子，即一個(gè)mRNA分子只為一種蛋白質(zhì)分子編碼。

真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對(duì)5’端和3’端的修飾以及對(duì)中間部分進(jìn)行剪接。

1．在5’端加帽

成熟的真核生物mRNA，其結(jié)構(gòu)的5’端都有一個(gè)m7G-PPNmN結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為甲基鳥苷的帽子。如圖17-9所示。鳥苷通過5’-5’焦磷酸鍵與初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的5’端相連。當(dāng)鳥苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN時(shí)，此時(shí)形成的帽子被稱為“帽0”，如果附m7G-PPNmN外，這個(gè)核糖的第“2”號(hào)碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，稱為“帽1”，如果5’末端N1和N2中的兩個(gè)核糖均甲基化，成為m7G-PPNmPNm2，稱為“帽2”。從真核生物帽子結(jié)構(gòu)形成的復(fù)雜可以看出，生物進(jìn)化程度越高，其帽子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。

圖17-9　Post-transcriptional modification of mRNa showing the7-methylguanosine cap and poly-A tail.

真核生物mRNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)的重要性在于它是mRNa 做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對(duì)核糖體對(duì)mRNA的識(shí)別提供了信號(hào)，這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNa 免遭5’外切核酸酶的攻擊。

2．在3’端加尾

大多數(shù)的真核mRNA 都有3’端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大約為200bp。

多聚（A)屠巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。受polyA聚合酶催化，該酶能識(shí)別，mRNa 的游離3’-OH端，并加上約200個(gè)A殘基。

近年來已知，在大多數(shù)真核基因的3’一端有一個(gè)AATAA序列，這個(gè)序列是mRNa 3’-端加polyA尾的信號(hào)。靠核酸酶在此信號(hào)下游10-15堿基外切斷磷酸二酯鍵，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200個(gè)A堿基。關(guān)于polyA尾巴的功能問題盡管經(jīng)過極其廣泛的探索，但還不完全清楚。有人推測(cè)polyA可能與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)送到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，但是相當(dāng)數(shù)量，的沒有polyA屠巴的mRNA如組蛋白mRNA，也照樣通過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。還有人認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)對(duì)真核mRNA的翻譯效率具有某種作用，并能穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)，保持一定的生物半衰期。

3.mRNA前體（hnRNA）的拼接

原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)編碼序列，而真核生物基因往往是斷裂基因，即編碼一個(gè)蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列被多個(gè)插入片斷所隔開，一個(gè)真核生物結(jié)構(gòu)基因中內(nèi)含子的數(shù)量，往往與這個(gè)基因的大小有關(guān)，例如胰島素是一個(gè)很小的蛋白質(zhì)，它結(jié)構(gòu)基因只有兩個(gè)內(nèi)含子，而有些很大的蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)基因中可以有幾十個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)過復(fù)雜的過程后，切去內(nèi)元，將有編碼意義的核苷酸片段（Extron外元也叫外顯子）連接起來（圖17-10）。

圖17-10　Primary polymerase 11transcript of a eukaryote gene showing(a)introns after capping and addition of polyA tail.(b)Excision of introns toform the mature mRNA is called splicing.

真核生物的結(jié)構(gòu)的基因中具有可表達(dá)活性的外顯子，也含有無(wú)表達(dá)活性的內(nèi)含子，但內(nèi)含子序列下是無(wú)意義的，越來越多的實(shí)驗(yàn)證明有許多基因中的內(nèi)含子參與基因表達(dá)調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄時(shí)，外顯子及內(nèi)含子均轉(zhuǎn)錄到hnRNA中。在細(xì)胞核中hnRNA進(jìn)行剪接作用，首先在核酸內(nèi)切酶作用下剪切掉內(nèi)含子；然后在連接酶作用下，將外顯子各部分連接起來，而變?yōu)槌墒斓膍RNA，這就是剪接作用，也有少數(shù)基因的hnRNA不需進(jìn)行剪接作用，例如α-干擾素基因，圖17-11以卵清蛋白基因?yàn)槔?，介紹一個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄及加工過程。

圖17-11　卵清蛋白基因轉(zhuǎn)錄及加工過程

圖中外顯示以1、2、3、4……表示，內(nèi)含子以A、B、C、D…表示

mRNA的拼接，需要在拼接部位有供拼接識(shí)別的保守性強(qiáng)的一致順序，通過對(duì)100多種真核細(xì)胞基因的分析，發(fā)現(xiàn)外元和內(nèi)元拼接部位部分堿基順序有一定的規(guī)律（見表17-4）。

表17－4　含有內(nèi)元的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其拼接處的堿基順序

基因區(qū)域ExonIntronExon卵清蛋白內(nèi)元2UAAG GUGA～～～～～～～ACAGGUUG卵清蛋白內(nèi)元3UCAG GUAC～～～～～～～UCAGUCUGβ-珠蛋白內(nèi)元1GCAG GUUG～～～～～～～UCAGGCUGβ-珠蛋白內(nèi)元2CAGG GUGA～～～～～～～ACAGUCUCIgλ內(nèi)含子1UCAG GUCA～～～～～～～GCAGGGGCSV40病毒早期T抗原UAAG GUAA～～～～～～～UUAGAUUC

表中劃線的堿基對(duì)拼接識(shí)別有重要作用，如將兔的β-珠蛋白的拼接部位的GT改為AT后，拼接反應(yīng)即受到影響。

mRNA前體拼機(jī)制

圖17-12　The RNA splicing mechanism.RNA splicing is catalyzed by aspliceosome formed from the assembly of U1,U2,U5,and sn RNPs(shown as greencircles )plus other components (not shown).After assembly of the spliceosome,the reaction occures in two speps:in step 1the branch-point A nucleotide inthe intron sequence,which is located colse to the 3'splice site ,attacks the5'splice site and cleaves it;the cut 5'end of the intron sequence therebybecomes covalently linked to this A nucleotide,forming the branched nucleotideshown in Figure 8-55.In step 2 the 3'-OH end of the first exon sequence,whichwas created in the first step,adds to the beginning of the second exonsequence,cleqving the RNA molecule at the 3'splice site;the two exon sequencesare thereby joined to each other and the intron sequence is released ad aribosone.These splicing reactions occur im the nucleus and gengerate mRNamolecules from primary RNA transcripts (mRNA precursor molecules).

mRNA拼接反應(yīng)需要有核內(nèi)小分子RNA參與它們與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物稱為小核糖核蛋白顆粒，SnRNA分別被命名為U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。SnRNA中的U2RNA由與內(nèi)元右端拼接部位附近的UACUAA順序高度互補(bǔ)，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由特定的酶來識(shí)別切除該環(huán)狀結(jié)構(gòu)，完成拼接過程，如圖17-12所示。

圖17-13　Mechanim of mRNa splicing.Note that,for clarity,the process is shownin two stages;energy is not required for the process since transesterificationreactions are involved.

真核生物 mRNA前體在剪接過程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個(gè)分支部位的腺苷酸殘基，它的2’-OH可以自動(dòng)攻擊內(nèi)含子5’端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開了外噗子1，而腺苷酸原來已有3’，5’--磷酸二酯鍵相連的兩個(gè)相鄰的核苷酸殘基，加上此3’，5’-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個(gè)套索，已被切下的外顯子1的3’-OH攻擊內(nèi)含子3’末端與外顯子2之間的3’，5’-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索的形式被節(jié)下來，此時(shí)外顯子1和外顯子2可以連接起來（圖17-13）。

不論拼接過程如何，拼接必須極為精確，否則會(huì)導(dǎo)致遺傳信息傳遞障礙，合成的蛋白質(zhì)可能喪失其正常的功能。我國(guó)南方廣大地區(qū)是β-地中海貧血的高發(fā)區(qū)，這是由于β-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制所引起的一種血紅蛋白病。實(shí)驗(yàn)表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的點(diǎn)突變改變了正常拼接部位的堿基順序，結(jié)果造成錯(cuò)誤部位的拼接。加工成熟的mRNA雖能翻譯，但產(chǎn)物不是正常的β-珠蛋白，結(jié)果引起血紅蛋白級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的改變。