《免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)》 二、最適工作濃度的選擇

在建立某一ELISA測(cè)定中，應(yīng)對(duì)包被抗原或抗體的濃度和酶標(biāo)抗原或抗體的濃度予以選擇，以達(dá)到最合適的測(cè)定條件和節(jié)省測(cè)定費(fèi)用。下面以間接法測(cè)抗體和夾心法測(cè)抗原為例，介紹最適工作濃度的選擇方法。

（一）間接法測(cè)抗體

1．酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇

（1）用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被，洗滌。

（2）將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。

（3）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸亮度（A），繪制曲線如圖15-10。讀取A值在1.0時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。該酶標(biāo)抗人IgG的工作濃度應(yīng)為1/1600。

2．棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度

（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被，洗滌。

（2）將強(qiáng)陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋，加樣，保溫，洗滌。

（3）加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫，洗滌。

（4）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后讀取A值。

（5）選擇強(qiáng)陽性參考血清的A值為0.8左右、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。表15-1為本例的測(cè)定結(jié)果，表中數(shù)字為A值。從表中可見1:200為最舒適的工作濃度。

表15-1 間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇

各類血清抗原稀釋度1:501:1001:2001:4001:800強(qiáng)陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.660.05稀釋液0.090.020.020.020.04

（二）夾心法測(cè)抗原

在夾心法ELISA法中可用棋盤滴定法同時(shí)選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度，舉例如下（表15-2）：

表15-2 夾心ELISA包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇

包被抗體的濃度及酶標(biāo)抗體稀釋度參考抗原強(qiáng)陽性（25ng/ml）弱陽性（1.5ng/ml）陰性10μg/ml1:10001.170.150.091:50000.460.031:250000.121μg/ml1:1000＞20.250.101:50000.910.120.011:250000.250.010.1μg/ml1:10000.420.130.131:50000.110.030.021:250000.03

（1）抗體免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為10、1和0.1μg/ml，分別在ELISA板上進(jìn)行包被，每一濃度包括三個(gè)縱行，洗滌。

（2）在一個(gè)橫行各包被孔中加入強(qiáng)陽性抗原液，另一橫行加入弱陽性抗原液，第三橫行加入陰性對(duì)照液，保溫，洗滌。

（3）將酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋成三個(gè)濃度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分別加入每一包被濃度的一個(gè)縱行中，保溫，洗滌。

（4）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取A值。

（5）以強(qiáng)陽性抗原的A值在0.8左右、陰性參考的A值小于0.1的條件作最適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。從表15-2可看出包被抗體濃度可選用1μg/ml，酶標(biāo)抗體的稀釋度可選為1:5000。為了進(jìn)一步節(jié)省試劑，可以此濃度為基點(diǎn)，縮小間距再做進(jìn)一步的棋盤滴定。