《免疫學和免疫學檢驗》 二、雙向擴散試驗

在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U散，在最恰當?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關(guān)系，可作出對抗原或抗體的定性分析。雙向擴散也可分為試管法和平板法兩種方法。

（一）試管法

試管法由Oakley首先報道。先在試管中加入含抗體的瓊脂，凝固后在中間加一層普通瓊脂，冷卻后將抗原液體加到上層。放置后，下層的抗體和上層的抗原向中間瓊脂層內(nèi)自由擴散，在抗原與抗體濃度比例恰當處形成沉淀線。此法分析效果與Oudin法相似，在臨床檢驗中罕用。

（二）平板法

平板法由Ouchterlony首先報道，是抗原抗體鑒定的最基本方法之一。該法的基本步驟是：在瓊脂板上相距3～5mm打一對孔，或者打梅花孔、雙排孔、三角孔等（圖12-5）。在相對的孔中加入抗原或抗體，置室溫或37℃18～24h后，凝膠中各自擴散的抗原和抗體可在濃度比例適當處形成可見的沉淀線。根據(jù)沉淀線的形態(tài)和位置等可作如下3種分析。

1．抗原或抗體的存在與否及其相對含量的估計沉淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致。沉淀線如靠近抗原孔，則指示抗體含量較大；如靠近抗體孔，則指示著抗原含量較多。不出現(xiàn)沉淀線則表明抗體或抗原過剩。另外，如出現(xiàn)多條沉淀線，則說明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此，可用于鑒定抗原或抗體的純度。

圖12-5雙擴散各種孔型圖

2．抗原或抗體相對分子量的分析抗原或抗體在瓊脂內(nèi)自由擴散，其速度受分子量的影響。分子量小者擴散快，反之則較慢。由于慢者擴散圈小，局部濃度較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方。如若兩者分子量相等，則形成。圖12－6顯示左側(cè)沉淀線抗原分子量大于抗體，右側(cè)沉淀線則抗體大于抗原，中間一條線則為兩者相等?？贵w多為IgG，分子量約15kD，未知抗原的分子量可做粗略估計。

圖12-6抗原抗體相對分子量示意圖

3．用于抗原性質(zhì)的分析兩種受檢抗原的性質(zhì)完全相同、部分相同或完全不同。三種情況在雙向擴散中表現(xiàn)的基本圖形見圖12-7。

從圖12-7可以分析出，左圖中兩種受檢抗原（Ag-a）完全相同，形成一個完全融合的沉淀線；右圖中抗體為雙價，兩種抗原完全不同（Ag-a和Ag-c）；中圖的抗體為雙價，兩種抗原（Ag-ab和Ag-ac）皆有相同的a表位，又有不同的b和c表位，所以沉淀線呈部分融合的形狀。這種技術(shù)作為抗原的分析，是目前免疫化學中最常用的鑒定技術(shù)之一。

圖12-7三種擴散基本圖型

4．用于抗體效價的滴定雙向擴散技術(shù)是抗血清抗體效價滴定的常規(guī)方法。固定抗原的濃度，稀釋抗體；或者抗原、抗體雙方皆作不同的稀釋，經(jīng)過自由擴散，形成沉淀線。出現(xiàn)沉淀線的最高抗體稀釋度為該抗體的效價。