《免疫學和免疫學檢驗》 一、單向擴散試驗

本試驗是在瓊脂膠中混入一定量抗體，使待測的抗原溶液從局部向瓊脂內自由擴散，在一定區(qū)域內形成可見的沉淀環(huán)。根據(jù)試驗形成可分為試管法和平板法兩種。

（一）試管法

該方法由Oudin于1946年報道。將血清或純化抗體混入約50℃的0.7％瓊脂糖溶液中，注入小口徑試管內，待凝固后，在凝膠中面加入抗原溶液，讓抗原自由擴散入凝膠內，在抗原與抗體比例恰當位置形成沉淀環(huán)。在黑色背景斜射光處，極易觀察這種白色不透明沉淀帶。

沉淀環(huán)的數(shù)目和形態(tài)受抗原和抗體性質的影響。溶液內含有多種抗原，在凝膠中含有各自的抗體，擴散后形成相應的抗原抗體復合物，出現(xiàn)多條區(qū)帶。試管上部的沉淀帶表示抗原量少或者抗體量多；反之，下面的沉淀帶則是抗原量大，抗體量少。另外，抗體類型也有很大區(qū)別，如用兔抗血清（R型抗體），抗體過量亦可形成復合物，因而沉淀帶寬而界線不清；如用馬抗血清（H型抗體），抗原或抗體過量皆不形成復合物，因而只在比例合適處形成界線清晰的沉淀物（圖12-1）。

圖12-1兩種抗血清形成的沉淀帶示意圖

（二）平板法

此法由Mancini于1965年提出，是目前最常用的簡易抗原定量技術，其要點是：將抗體或抗血清混入0.9％瓊脂糖內（約50℃），未凝固前傾注成平板，凝固后在瓊脂板上打孔（一般直徑約3～5mm），孔中加入抗原溶液，放室溫或37℃讓其向四周擴散，24～48h后可見周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)（圖12-2）。

圖12-2單向輻射狀免疫擴散

上排為5個不同的參考中、下排為患者血清

下排右2為一異常病理血清

由于試驗中抗原向四周擴散，故又稱單向輻射狀免疫擴散（singleradialimmunodeffusion，SRID）。最后，測量沉淀環(huán)的直徑或計算環(huán)的面積。沉淀環(huán)直徑或面積的大小與抗原量相關，但不是直線相關，而是對數(shù)關系。同時，這種沉淀還與分子量和抗散時間有關?？乖颗c環(huán)徑的關系有兩種計算方法：

1．Mancini曲線適用于大分子抗原和長時間擴散（＞48h）的結果處理。使用方格計算紙劃線，擴散環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關系（圖12-3）。

利用公式表示：C/d2＝K

圖12-3Mancini曲線

T1為1624h；T2為24～48h；T3為48h以上；可見T3為直線，T1為反拋物線

式中C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù)。

2．Fahey曲線這種曲線適用于小分子抗原和較短時間（24h）擴散的結果處理。使用半對數(shù)劃線，濃度的對數(shù)與擴散圈直徑之間呈線性關系（圖12-4）。

用公式表示：log/d＝K

式中C＝抗原濃度（mg/d），d＝沉淀環(huán)直徑，K＝發(fā)常數(shù)。

各種蛋白質只要符合以下3條，幾乎皆可用SRID定量測定：①備有僅對某待測抗原的單價特異抗血清；②備有已知含量的標準品；③待測品含量在1.25μg/ml以上（單向擴散技術的敏感度）?，F(xiàn)在最常用于臨床檢測的項目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白。

在檢測標本的同時，用已知含量的標準抗原作5～7個稀釋度，同時測量圈的大?。ㄒ妶D12-2）。按擴散時間（Fahey和Mancini法）的不同，取方格紙或對數(shù)紙做標準曲線圖。

單向瓊脂免疫擴散法作為抗原的定量方法，其重復性和線性皆是可信賴的，唯敏感度稍差（不能測μg/ml以下含量）。另外，以下影響因素也應注意。

1．抗血清不但要求親和力強、特異性好、效價高，而且還應注意存放的方法，防止效價下降。

2．標準曲線測定必須同時制作，決不可一次做成，長期應用。

3．測定時必須同時加測質控血清，以保證測量準確性。

4．有時出現(xiàn)擴散圈呈兩重沉淀環(huán)的雙環(huán)現(xiàn)象。這是由于出現(xiàn)了不同擴散率、但抗原性相同的兩個組分。例如α重鏈病血清中出現(xiàn)的α重鏈和正常IgA發(fā)生反應，就形成內外兩重環(huán)（圖12－2）。

圖12-4Fahey曲線

t1為1624h；t2為2448h；t3為48h以上可見t1為直線，t3為拋物線

5．在單向擴散試驗時，有時會出現(xiàn)結果與真實含量不符，這主要出現(xiàn)在Ig測定中。如用單向克隆抗體或用骨髓抗原免疫動物獲得的抗血清，都存在結合價單一的現(xiàn)象，若用此作為單向擴散試劑測量正常人的多態(tài)性抗原，則抗體相對過剩，使沉淀圈直徑變小，測量值降低。

6．測得結果的假陽性升高現(xiàn)象與上面相反，如用多克隆抗體測定單克隆?。∕蛋白），則抗原相對過剩（單一抗原決定簇成分），致使沉淀圈呈不相關的擴大，從而造成某一成分的偽性增加。