《臨床基礎(chǔ)檢驗(yàn)學(xué)》 二、血紅蛋白測(cè)定

（一）血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)及成分

血紅蛋白是在人體有核紅細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)匐成的一種含色素輔基的結(jié)合蛋白質(zhì)。色素部分是亞鐵血紅素，蛋白質(zhì)部分是珠蛋折，血紅素是由原卟啉和鐵原子組成的一種結(jié)合物，亞鐵原子的六個(gè)配位鍵中的四個(gè)與原卟啉的四個(gè)吡咯壞的氮原子相邊，一個(gè)與珠蛋白的肽鏈F肽段第八個(gè)氨基酸------組氨酸的咪唑基相邊，另一個(gè)鍵則可逆性地與氧結(jié)合，完成運(yùn)氧功能。當(dāng)各種原困使Fe2+氧化成Fe3+即喪失攜氧功能。與一切蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一樣，Hb的珠蛋白部分是由兩條α鏈（α鏈及胚胎時(shí)的ξ鏈）和兩條非α鏈（β鏈、γ鏈、δ鏈及胚胎時(shí)的ε鏈）組成。α鏈由141個(gè)氨基酸組成，β鏈由146個(gè)氨基酸組成。兩對(duì)肽鏈聚合成四聚體、即Hb分子，亞鐵血紅素結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2-2。

圖2－2　亞鐵血紅素結(jié)構(gòu)式

Hb的合成受激素的調(diào)節(jié),影響Hb合成的激素有兩種.一種是紅細(xì)胞生成素,可促δ-氨基-γ酮戊酸(ALA)生成與鐵的利用,從而促進(jìn)血紅素和Hb 二是雄激素,睪酮在肝臟內(nèi)由5-β還原酶轉(zhuǎn)變?yōu)?-β氫睪酮,它能促進(jìn)ALA合成酶的生成.雄激還能促進(jìn)紅細(xì)胞生成素的生成,直接和間接促進(jìn)Hb的合成.當(dāng)血紅素合成過(guò)多時(shí),血紅素自發(fā)氧化為高鐵血紅素,高鐵血紅素對(duì)ALA合成酶有直接抑制作用,關(guān)能阻遏ALA合成酶生成,進(jìn)而減少血紅素的合成.

在人體不同生長(zhǎng)時(shí)期Hb種類與比例不同.在胚胎發(fā)育早期,大約于妊娠第5周,ζ與ε基因即表達(dá)于卵黃囊的成紅細(xì)胞中,形成了人個(gè)體發(fā)育中第一個(gè)有功能的胚胎期血紅蛋白四聚體ζ2ε2(HbGower I)在妊娠第6 周,成紅細(xì)胞開(kāi)始由卵黃囊游移到肝臟,此時(shí)ζ表達(dá)水平顯著降低,α和γ基因開(kāi)始表達(dá),由這些肽鏈組成3種胚胎期血紅蛋白,好Hb GowerI(ζ2ε2),Hb GowerⅡ(α2ε2),HbPortland(ζ2γ2)和一種胎兒血紅蛋白HbF（α2γ2），到胚胎發(fā)育第8周，ζ和ε鏈逐漸消失，γ鏈合成達(dá)到最高峰，而且開(kāi)始有β鏈合成，即有成人血紅蛋白HbA（α2β2）產(chǎn)生。36周后β鏈合成迅速增加，γ鏈合成速率降低，出生后不久可見(jiàn)β與γ鏈合成大致等量，生后3個(gè)月由于鏈合成繼續(xù)增加，而γ鏈合成迅速降低而至HbA占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，逐步占95%以上。而HbA逐步下降到小于等于1%。δ鏈開(kāi)始合成的確切時(shí)間不很清楚，由于臍帶血中存在微量的δ鏈，說(shuō)明它在胎兒時(shí)期已經(jīng)開(kāi)始合成，出生后占Hb總量的2%-3%。成有血紅蛋白按不攜氧計(jì)算分子量為64458。

在正常狀態(tài)機(jī)體有99%Hb的鐵原婦呈Fe2+狀態(tài)，稱為還原Hb ,1%o Fe3+為高鐵血紅蛋白只有亞鐵狀態(tài)的Hb才能與氧結(jié)合，此時(shí)稱氧合血紅蛋白。一氧化碳與可以與Hb結(jié)合碳氧血紅蛋白且其結(jié)合力高于氧結(jié)合力210倍，如果HbO2在含人有苯肼和硫化氫的環(huán)境中即轉(zhuǎn)變?yōu)榱蚧t蛋白。SHb常可出現(xiàn)在服用阿司匹林和可等待困患者血中。

（二）氰化高鐵積壓紅蛋白測(cè)定法

自從1875年Gower設(shè)計(jì)了稀釋溶血液目測(cè)比色法以來(lái)，血液學(xué)工作者對(duì)Hb測(cè)定進(jìn)行了大量探討，大致分為①根據(jù)Hb分子組成測(cè)定總Hb法（全血鐵法）；②根據(jù)血液物理物性測(cè)Hb(比重法、折射儀法)；③根據(jù)Hb與O2可逆性結(jié)合的物性測(cè)Hb（血?dú)夥终鄯ǎ┖廷芨鶕?jù)Hb衍生物光譜特點(diǎn)進(jìn)行的定量測(cè)定法等四大類，其中有些方法簡(jiǎn)單易行，而得到長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用（如沙利法），但隨著技術(shù)的進(jìn)步和研究的深入，缺點(diǎn)日漸顯著，逐漸被淘汰。為統(tǒng)一Hb測(cè)定方法，1966年國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員全推薦氰化高鐵血紅蛋白測(cè)定法作為國(guó)際Hb測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)法。1978年國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)和世界病理學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)發(fā)表的國(guó)際性文件中重申了HICN法。

[原理] 血液在血紅蛋白轉(zhuǎn)化液中溶血后，除SHb外各種血紅蛋白均可被高鐵氰化鉀氧化高鐵血紅蛋白，再與CN-結(jié)合生成穩(wěn)定的棕紅色氰化高鐵積壓紅蛋白。HICN最大吸收波峰在540nm,最小吸收谷為504nm。特定標(biāo)準(zhǔn)條件下，毫摩爾消光系數(shù)為44L.mmol-1.cm.因此根據(jù)標(biāo)本的吸光度，即可救是血紅蛋白濃度。HICN吸收光譜曲線特點(diǎn)見(jiàn)圖2-3。

圖2－3　氰化高鐵血紅蛋白光譜吸收曲線

在沒(méi)有符合WHO標(biāo)準(zhǔn)的分光光度計(jì)的條件下，亦可用HICN參考液制標(biāo)準(zhǔn)曲綞，或耱出換算常數(shù)，間接計(jì)算血紅蛋白濃度（g/l）。

[方法學(xué)評(píng)價(jià)] HICN法具有操作簡(jiǎn)單、顯色快且穩(wěn)定（顯色后如保存得當(dāng)可六年不退色），除SHb外各種血紅蛋白均可檢測(cè)、讀取吸光度后可直接定值等優(yōu)點(diǎn)。

HICN的消光系數(shù)是44mmol-1.cm-1?？筛鶕?jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

A/44×64458（mg）/1000×251=A×367.7=Hb（g/l）

式中A 是在540nm處HICN吸光度，64458mg是Hb 的毫克分子量，1000是將毫克轉(zhuǎn)換為克，251是實(shí)驗(yàn)時(shí)血液的稀釋倍數(shù)。但使用367.7這處常數(shù)是有條件的，是基于在儀器，比色杯，試劑及操作均嚴(yán)格的要求下，才能直接使用。儀器的校正是測(cè)定的關(guān)鍵，決定著測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確與否。在實(shí)際工作中，使用的分光光度計(jì)很難達(dá)到上述要求，往往通過(guò)K值來(lái)校正結(jié)果，定期地檢查K值十分重要。HICN法被列為國(guó)際血紅蛋白測(cè)定的參考方法。HICN法逐漸在國(guó)內(nèi)普及，對(duì)Hb測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化起了一定作用，但在實(shí)際應(yīng)用中尚存在一些問(wèn)題，關(guān)非理想的方法。其致命點(diǎn)是KCN有劇毒，使用管理不當(dāng)可造成公害，此外高白細(xì)胞和高球蛋白血癥可致混濁，以及HbCO轉(zhuǎn)化較慢的問(wèn)題也未完全解決。

實(shí)際工作中，多采用替代方法進(jìn)行Hb測(cè)定，將其結(jié)果校下在到HICN法水平。國(guó)內(nèi)多采用十二烷基硫酸鈉血紅蛋白測(cè)定法，其原理是，除SHb外，血液中各種Hb均可與低濃度SDS作用，生居SDS-Hb棕紅色化合物。其吸收曲線波峰在538nm，小組谷在500nm 肩峰在560nm。由于摩爾消光系數(shù)尚未最后確認(rèn)，因此不能用吸光度A直接計(jì)算Hb濃度。本法可用HICN法定值的抗凝血或溶血液，制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，間接計(jì)算血紅蛋白濃度本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，呈色穩(wěn)定，準(zhǔn)確性和精確性符合要求無(wú)公害，在全國(guó)臨床檢驗(yàn)方法學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議上，被推薦為次選方法。但SDS本身質(zhì)量差異較大且SDS破壞白細(xì)胞，不適于同時(shí)蛤有計(jì)數(shù)白細(xì)胞和Hb定量?jī)煞N功能和血細(xì)胞分析儀使用。

疊氮高鐵血紅蛋白測(cè)定法具有與HICN相似的優(yōu)點(diǎn)，最大吸收峰在542nm，且峰值高度幾乎與HICN者重合，文獻(xiàn)報(bào)道HICN與HIN3兩者結(jié)果回歸方程的截距僅為0.013或?yàn)?，實(shí)驗(yàn)時(shí)顯色快且穩(wěn)定。試劑毒性僅為HICN者的1/7，至今仍有人用于臨床，但仍存在公害問(wèn)題。

Zander（1984）年提出堿羥血紅蛋白（AHD575）測(cè)定法，575nm為其檢出波長(zhǎng)。該法試劑簡(jiǎn)單，不含有毒劑。呈色穩(wěn)定，可用氯化血素作標(biāo)準(zhǔn)品，已被許多單位采用。但由于自動(dòng)積壓細(xì)胞分析儀或血紅蛋白測(cè)定儀多采用540nm左右范圍濾光板（圖為HICN最大吸收峰在540nm），限制了此法在該類儀器的使用。

沙利酸化血紅蛋白測(cè)定法。雖操作簡(jiǎn)單但誤差較大，已被列為縣以上醫(yī)院淘汰的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。

近年來(lái)，多參數(shù)血細(xì)胞公析儀的應(yīng)用，使Hb測(cè)定逐步以儀器法取代手工法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速，同時(shí)可以獲得多項(xiàng)紅細(xì)胞的參數(shù)，但由于各型號(hào)儀器使用的溶血?jiǎng)┎煌?，形成Hb的衍生物不同。某些溶血?jiǎng)┬蚊娴难苌锓€(wěn)定性較差（如2%十六基三甲基溴化銨），因此要嚴(yán)格控制血?jiǎng)┘尤肓考叭苎獣r(shí)間，特別半自動(dòng)血細(xì)胞分析儀嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。有些溶血?jiǎng)﹥?nèi)雖加入了KCN，但其衍生拖把關(guān)非是HICN，儀器要經(jīng)過(guò)HICN標(biāo)準(zhǔn)液校正后，才能進(jìn)行Hb測(cè)定。