《基因診斷與性傳播疾病》 第七節(jié)　診斷

單靠臨床表現(xiàn)不能診斷CMV感染，從臨床標(biāo)本中分離出病毒，同時(shí)抗體呈出4倍以上增加或持續(xù)抗體滴度升高，將有助于診斷。

一、病毒分離

最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白細(xì)胞，接種到人的成纖維細(xì)胞內(nèi)繁殖和分離，細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）在1天或數(shù)周后出現(xiàn)，經(jīng)固定和HE染色后可觀察到巨細(xì)胞，核內(nèi)有內(nèi)包涵體，核周暈圈及嗜酸性胞漿內(nèi)包涵體，很象“貓頭鷹眼”（owl′s eye）亦可用單克隆或多克隆抗體的熒光染色等方法檢查。

二、血清抗體檢測(cè)

最常用的有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）、間接免疫熒光試驗(yàn)（IIF）、免疫酶試驗(yàn)（EIA）、間接血凝試驗(yàn)（IHA）和放射免疫試驗(yàn)（RIA）等檢測(cè)CMV-IgG和IgM抗體。當(dāng)單份血清標(biāo)本已確定既往有CMV感染時(shí)，應(yīng)當(dāng)立即留血清標(biāo)本，以及間隔2周、4周、8周再留血清標(biāo)本，結(jié)合病毒分離可作原發(fā)感染診斷。

三、DNA探針

已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)CMV，其中以32P標(biāo)記的探針敏感性最高，對(duì)某些標(biāo)本來說，雜交方法可能比病毒分離更敏感。

四、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

（一）標(biāo)本的采集及處理

采集的標(biāo)本包括患者的血液、尿，以及腺體組織等。由全血制備的血沉棕黃層（buffy coats）可保存于-80℃；尿液標(biāo)本可保存于液氮中。凍存標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

尿液標(biāo)本經(jīng)2500r/min離心10min，以除去細(xì)胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制劑，因此需用聚乙二醇（PEG6000）進(jìn)行預(yù)處理：50μl尿上清與50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min離心30min收集沉淀。再于6400r/min離心3min；盡可能吸去上清，將沉淀懸浮于蒸餾水中。該懸液可直接用于PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增時(shí)應(yīng)于100℃加熱10min，迅速置冰浴中冷卻。

（二）模板DNA的制備

1．由血液標(biāo)本制備模板DNA

方法A：向血清中加入NaCl使最終濃度為150mmol/L；取10μl 此血清于70℃處理45s后即可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

方法B：由血沉棕黃層（BCP）制備：① 用PBS洗滌BCP兩次，收取沉淀。②加入500μl 6mol/L鹽酸胍，勻漿。③ 加入30μl 10mmol/l EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K（10mg/ml），混合均勻，60℃反應(yīng)1h。④加入1130μl 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。⑤ 離心收集DNA沉淀。⑥用70%乙醇洗兩次，最后將沉淀懸浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/l EDTA中。置4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.由冰凍組織標(biāo)本制備模板DNA：①用恒冷切片機(jī)切取一塊5～10μm冰凍組織塊，置于1.5ml塑料管中。②加入10%用緩沖液配制的福馬林。③ 10min后離心1～2min輕輕傾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④于室溫干燥10～60min。⑤ 加入抽提緩沖液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/l EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使剛好浸沒沉淀物（約50～100μl）；將沉淀搗碎。福馬林固定的或石蠟包埋組織經(jīng)脫蠟和干燥后也可按此處理。⑥37℃放置過液。⑦ 置沸水中7min滅活蛋白酶K。⑧離心收集上清，取1～10μl 即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.由尿液標(biāo)本制備模板DNA：①100μl 尿上清液與100μl 6mol/L異硫氰酸胍，7μl 2mol/LNaCl和20μl 玻璃粉懸液（DNa PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。② 室溫放置10min后，6400r/min離心2min，收集沉淀。③沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min離心1min。④同樣洗滌沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸餾水，于55℃作用15min。⑥15000r/min離心2min，收集上清（含HCMV DNA），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將此懸液于100℃加熱10min，并迅速于冰浴中冷卻。

（三）引物及探針

引物及探針的設(shè)計(jì)是根據(jù)已發(fā)表的CMV的直接早期蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)和開始的4個(gè)外顯子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探針列在表3中。

（四）PCR擴(kuò)增步驟

1．10×反應(yīng)緩沖液：100mmol/LTris-HCl、pH8.4，500mmol/l KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明膠。

Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。

10×dNTP：4種dNTP各2.0mmol/L。

引物：100pmol/L。

2．常規(guī)PCR擴(kuò)增

10×反應(yīng)混合物（50μl）反應(yīng)緩沖液 5μl

10×dNTP　5μl

模板DNA　5μl

Taq DNA聚合酶　0.2μl (IU)

引物 各0.5μl

蒸餾水 3.8μl

加1～2滴礦物油。

將反應(yīng)混合物于94℃加熱5min；然后于95℃ 30s，55℃40s，72℃ 60s，擴(kuò)增35～40循環(huán)。

表3　CMV PCR擴(kuò)增所用的引物及探針

引物及探針序列（5′→3′）位置片段大小IE1CCACCCGTGGTGCCAGCTCC早期基因159（bp）IE2CCCGCTCCTCCTGAGCACCCIE3（探針）CTGGTGTCACCCCCAGAGTCCCCTGTACCCGCGACTATCCLA1CCGCAACCTGGTGCCCATGG晚期gp64139LA2CGTTTGGGTTGCGCAGCGGGLA3（探針）TTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCGIE1aAGATCGCCTGGAGACGCCAT早期外顯子1139IE1bGGAATCCGCGTTCCAATGCAIE2aATGGAGTCCTCTGCCAAGAG早期外顯子272IE2bCCGTGGCACCTTGGAGGAAGIE3aGTGACCAAGGCCACGACGTT早期外顯子3167IE3bTCTGCCAGGACATCTTTCTCIE4aACAGATTAAGGTTCGAGTGC早期外顯子4179IE4bCAATACACTTCATCTCCTCGIE4cTTACCAAGAACTCAGCCTTC早期外顯子4158IE4dGTGCGTGAGCACCTTGTCTCIE4eTATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA早期外顯子4426IE4fATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAGPp1aTAGCGCGCATACATCCCGAGTACATPp71基因316Pp1bATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACCPp71

3．套式（nested）PCR擴(kuò)增：①反應(yīng)混合物的組成同（2），僅引物為IE2a和IE4b（包括了整個(gè)外顯子3，共721b），各100pmol。于94℃60s，52℃150s，72℃ 480s，擴(kuò)增20循環(huán)。② 取2μl 上述擴(kuò)增產(chǎn)物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b補(bǔ)加其他試劑。然后，于94℃60s，52℃150s，72℃180s，擴(kuò)增20循環(huán)。

（五）產(chǎn)物鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物的分析可采用固相（濾膜）雜交和液相雜交試驗(yàn)。

1． 固相雜交：

① 預(yù)雜交液為3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有擴(kuò)增產(chǎn)物的濾膜于42℃預(yù)雜交30～60min。②加入標(biāo)記探針（10cpm/μg，2ng/ml），雜交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分別于室溫洗滌濾膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室溫洗一次以上,5min/次。④自顯影。

2． 液相雜交及電泳分析：

① 取1/10體積的擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5～1.0pmol末端記的探針混合。②加入最終濃度為150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸鈉及1mmol/L EDTA溶液，使總體積為20μl 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 離心10s加入樣品緩沖液，于8%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。⑤電泳畢，用溴化乙錠染色，然后對(duì)X線片曝光，自顯影。

HCMV DNA分子很大，其堿基序列尚未全部搞清。雖然它的DNA的限制性內(nèi)切酶片段長度具多形性，但是對(duì)其基因組的離散性還不清楚。用單一引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可鑒定90%的HCMV野型分離株；而采用針對(duì)不同HCMV序列的兩套以上的引物對(duì)，則可檢測(cè)幾乎所有的病毒株。因此，可根據(jù)情況使用兩對(duì)或兩對(duì)以上的位于基因組不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

在HCMV模板DNA制備過程中，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些小片段DNA，在PCR反應(yīng)時(shí)常導(dǎo)致一定水平的本底產(chǎn)物，從而影響對(duì)結(jié)果的判定。在這種情況下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的擴(kuò)增分為兩步：首先利用一對(duì)引物，擴(kuò)增包括靶DNA在內(nèi)的長片段DNA；然后取少量的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用只針對(duì)靶DNA的引物再進(jìn)行第二次擴(kuò)增。通過控制每步中的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，即可防止由小片段DNA引起的假陽性。這種方法也可避免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

PCR檢測(cè)HCMV標(biāo)本具有很高的敏感性。從HCMV感染的組織培養(yǎng)上清可檢測(cè)到相當(dāng)于幾十個(gè)病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探針進(jìn)行Southern雜交分析擴(kuò)增產(chǎn)物，可從尿液標(biāo)本中檢測(cè)到1pgHCMv DNA序列的水平；利用該系統(tǒng)，在4×104個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)病毒基因組即可檢測(cè)出，較斑點(diǎn)印跡雜交提高2×103倍。

PCR技術(shù)對(duì)HCMV感染的檢測(cè)具有臨床應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)轶w液中病毒DNA先于病毒感染的臨床癥狀或血清學(xué)證據(jù)的出現(xiàn)，可作為HCMV感染的早期指標(biāo)。由于HCMV可通過胎盤內(nèi)感染、產(chǎn)道感染等途徑傳播，而且受感染的新生兒死亡率較高，因此利用PCR進(jìn)行早期診斷及采取及時(shí)的治療措施，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育也有重要意義。利用這種方法，還可鑒定器官或組織移植手術(shù)中供體是否為HCMV與許多嚴(yán)重病癥的關(guān)系。再者，PCR檢測(cè)指標(biāo)穩(wěn)定，還可進(jìn)行半定量分析，因此可作為評(píng)價(jià)各種抗病毒藥物療效的手段。