《動(dòng)脈粥樣硬化》 一、ApoE表型檢測(cè)的方法學(xué)

ApoE表型檢測(cè)即可以以VLDL為樣品，又可以直接以血清（或血漿）為樣品，通過(guò)IEF電泳分析、雙向PAGE或結(jié)合免疫印跡法進(jìn)行測(cè)定。

1．等電聚焦（IEF）：由于三種主要ApoE異構(gòu)體E2、E3和E4的等電點(diǎn)（pⅠ）分別為5.89、6.02和6.68，E4比E3多一個(gè)正電荷，而E2比E3少一個(gè)正電荷。因此，可應(yīng)用1EF檢測(cè)這些異構(gòu)體間電荷差異而確定不同ApoE表型。傳統(tǒng)ApoE表型檢測(cè)方法多采用超速離心法或化學(xué)沉淀法分離VLDL，脫脂后進(jìn)行IEF，然后進(jìn)行染色分析。這種方法需要血清量較多，昂貴、費(fèi)時(shí)，又需要大型設(shè)備，不適合大規(guī)模研究。ApoE異構(gòu)體之間染色程度之間差異及電泳過(guò)程中泳動(dòng)距離的變異性也造成結(jié)果的不穩(wěn)定性。

2．免疫印跡法（immunoblotting）：血清脫脂后，經(jīng)IEF電泳將ApoE與其他蛋白質(zhì)分離，然后將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上，用抗ApoE抗體作為一抗進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)或采用直接的免疫固定法，即可靈敏而特異地顯示出ApoE區(qū)帶的位置，從而確定ApoE表型。此方法利用抗原-抗體的特異反應(yīng)，排除了血清其他蛋白質(zhì)的干擾，不需超速離心分離VLDL，血清用量少，是國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ApoE表型常用的方法之一。但此類方法亦存在一些缺點(diǎn)，如對(duì)于存在與普遍異構(gòu)體具有相同電荷的罕見異構(gòu)體標(biāo)本，或在糖尿病等病理狀態(tài)時(shí)，由于轉(zhuǎn)錄后修飾引起蛋白質(zhì)變化的標(biāo)本檢測(cè)時(shí)，就會(huì)給出錯(cuò)誤的結(jié)果。

3．雙相電泳（two-dimensionalelectrophoresis）

第一相應(yīng)用IEF電泳將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)分離；第二相根據(jù)蛋白質(zhì)分子量不同及濃度的差異，應(yīng)用SDS-PAGE進(jìn)行分離，由此確定ApoE表型。此技術(shù)能解決IEF遇到的一些轉(zhuǎn)錄后修飾的問(wèn)題，臨床標(biāo)本用量也很少，并且可以同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，但由于成本昂貴而且費(fèi)時(shí)，有時(shí)也難以清晰地分辨表型，故臨床上應(yīng)用較少。