《動脈粥樣硬化》 二、IEF電泳檢測ApoE表型

本法以VLDL為測定樣品。首先利用超速離心機自血清中分離VLDL，一方面可去除血清雜蛋白的干擾，另一方面也可達到富集ApoE的作用，因ApoE主要存在于VLDL。

1．儀器與試劑

電泳儀，垂直板式電泳槽，超速離心機，光密度計，大培養(yǎng)皿；主要試劑有：①1.00g/mlNaBr與1.20g/ml NaBr溶液；②脫脂液為乙醇/乙醚混合液（3：1,V/V）；③樣品溶解液為0.01mol/l Tris-HCl,pH8.2,內(nèi)含1%SDS，5%β-巰基乙醇及13%蔗糖；④凝膠貯存液；丙烯酰胺（Acr）30g，NN’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）1.2g，加水至100ml；⑤電極緩沖液：0.01mol/lH3PO4（陽極），0.02mol/L NaCl（陰極）；⑥凝膠應用液：PAG濃度為7.5%，內(nèi)含1.6%兩性電解質(zhì)載體(Ampholyte,pH4.0～6.5,Pharmacia)；⑦0.2%CBBG250染色液；⑧脫色液：甲醇/水/乙酸溶液（5：5：1，V/V）。

2，實驗方法

①人血清VLDL的分離；取血清3.0ml，加入固體NaBr使其密度增加至1.30g/ml。在BeckmanL8-80離心機Ti80轉(zhuǎn)頭離心管中依次加入密度為1.00g/ml,1.20g/ml的NaBr溶液和1.30g/ml的血清樣品，形成1.00～1.30g/ml的不連續(xù)密度梯度。10℃，70000r/min超速離心2h，離心后在管頂層可見白色乳狀液體，此即為VLDL，小心收集0.3～0.5ml并轉(zhuǎn)移至已準備好的脫脂管內(nèi)脫脂。②VLDL的脫脂：按Scanu(1971)法進行。先用3：1（V/V）乙醇/乙醚混合液在-20℃脫脂兩次，每次9～12h，繼用乙醚脫脂1次，2h。每次脫脂后在-15℃離心收集沉淀，3000r/min,15min。末次離心后在管中加入0.01mol/l Tris-HCl,pH8.2，內(nèi)含1%SDS，2%兩性電解質(zhì)載體，5%β-巰基乙醇及13%蔗糖的溶液60μl，并在室溫下孵育30min，最后用氮氣吹盡殘存的乙醚，此即為IEF電泳的樣品。③IEF電泳：按Menzel等（1983）法進行。垂直板PAG濃度為7.5%，內(nèi)含1.6%pH4.0～6.5的兩性電解質(zhì)載體。電泳凝膠用0.2%CBBG250染色。脫色后至圖像清晰后照像掃描。④ApoE表型判定：根據(jù)電泳圖譜，依據(jù)E2、E3、E4各區(qū)帶光密度比例確認ApoE各表型，如圖19-3和表19-1所示。

圖19-3 VLDL的IEF-PAGE圖

表19-1ApoE表型的鑒定

表型IEF凝膠電泳區(qū)帶吸光度E4/4E4（+），E4>>E3，E2E3/3E4（-），E2/E3＜1E2/2E4（-），E2/E3＞1E4/3E4（+），E2/E3＜1E4/2E4（+），E2/E3＞1E3/2E4（-），E2/E3＞1

由于ApoE即有主要異構(gòu)體，又有次要異構(gòu)體，有時使表型確定較為困難。一般情況下，應用此法較易確定ApoE純合子表型，但對于某些雜合子表型的判定要慎重，往往要在色帶經(jīng)過光密度掃描以后，根據(jù)兩條色帶顏色深淺之比才能最后定論。如仍難以確定時，可用唾液酸酶處理VLDL，使次要異構(gòu)體減少或消失，而有利于表型的判定。