《動(dòng)脈粥樣硬化》 三、免疫印跡法檢測(cè)ApoE表型

由于IEF法需大型設(shè)備，工作量較大，極大地限制了該法的臨床應(yīng)用。免疫印跡法為目前檢測(cè)ApoE表型最常用方法。此法直接用血清（或血漿）作為樣品，脫脂后進(jìn)行IEF電泳，然后用特異性多克隆或單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，根據(jù)黑色后圖譜即可確定ApoE表型。此法比IEF法更省時(shí)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。

1．儀器與試劑

電泳儀，垂直板式電泳槽，轉(zhuǎn)移電泳槽，NC膜；主要試劑有：⑴3：1（V/V）乙醚脫脂液；⑵樣品溶解液；0.01mol/l Tris,pH8.6,內(nèi)含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素；⑶兩性電解質(zhì)（Ampholine,pH4～6,LKB產(chǎn)品）；⑷丙烯酰胺（Acr）、N-N'甲叉雙丙烯酰胺（Bis），Serva產(chǎn)品；⑸TEMED（Sigma產(chǎn)品）；⑹電泳緩沖液：1mol/lNaOH,1mol/L H3PO4；⑺轉(zhuǎn)移電泳緩沖液：含20%甲醇，39mmol/L甘氨酸，48mmol/lTris和0.0375%SDS；⑻洗滌液（TPBS）含0.05%吐溫-20，0.9%NaCl的10mmol/LPBS,pH7.4；⑼封閉液：含0.18%兔血清的TPBS或含3%BSA的TPBS；⑽羊抗人ApoE多克隆抗血清；⑾HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG：⑿4-氯-1-萘酚（Sigma產(chǎn)品）。

2．實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品處理：抽取空腹血1～2ml，分離血清。取血清10μ置于預(yù)冷乙醇/乙醚（3：1）脫脂液中-20℃脫10h以上，離心（2500r/min）15min，棄上清后的加等量預(yù)冷的無水乙醚繼續(xù)脫脂0.5h，再次離心，將沉淀樣品用氮?dú)獯蹈苫虺檎婵帐箽堄嘁颐褤]發(fā)；（2）IEF電泳：電泳前將樣本溶解在100μl溶解液中（0.01mol/l Tris,pH8.6,內(nèi)含0.01mol/LDTT,8mol/L尿素），放置37℃，1h。PAG凝膠濃度為5%，內(nèi)含尿素（8mol/L），2%Ampholine,0.025%過硫酸胺（AP）及0.033%TEMED。電極液：陰極為1mol/LNaOH，陽極為1mol/LH3PO4。每份樣品加樣20μl，IEF條件初為300V，0.5h,然后調(diào)至700V，電泳5h?；?000V預(yù)冰30min（10℃）后，關(guān)電源，在靠陰極處放上IEF加樣箔，每一空內(nèi)加樣后，繼續(xù)電泳2h30min；（3）免疫印跡：轉(zhuǎn)移電泳條件18V/cm，按轉(zhuǎn)移電泳槽要求將凝膠上的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到NC膜上。5h后取出NC膜，放入封閉液內(nèi)，室溫過夜。用TPBS洗3次，然后用羊抗人ApoE抗血清（1：2000TPBS稀釋）室溫孵育6h。傾去液體，充分洗滌后，加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG（1：200）室溫孵育2h。用PBS洗膜3次，每次10min。稱取12mg4-氯-1-萘酚溶在4ml冷甲醇（-20℃）中，放入20mlPBS，加入10μ130%H2O2，放入已洗凈的NC膜，緩緩搖動(dòng)至蛋白帶顯出，蒸餾水洗后，晾干，暗處保存；（4）ApoE表型判定：根據(jù)所顯示ApoE區(qū)帶圖譜即可確定ApoE表型，見圖19-4所示。

圖19-4 6種ApoE表型免疫印跡圖（模式）

此方法樣品用量少（10～20μl血清即可），故特別適合臨床檢驗(yàn)與大規(guī)模人群調(diào)查。由于ApoE糖類含量會(huì)影響IEF結(jié)果，所以在IEF前常用唾液酸酶預(yù)處理標(biāo)本，以除去唾液酸殘基。唾液酸酶的處理加強(qiáng)了主要區(qū)帶，減弱了干擾的唾液酸型區(qū)帶，克服了未用酶處理時(shí)，E3/2和E3/3有時(shí)難以分辨的困難，提高了表型判別的準(zhǔn)確性。另外，如選用pH4～8范圍的梯度作IEF電泳，則幾乎能檢測(cè)出至今為止所發(fā)現(xiàn)的所有異構(gòu)體表型。國內(nèi)呂新躍等應(yīng)用自制E6C3株ApoE單克隆抗體作為一抗，用兔抗鼠IgG-辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，建立微量脫脂血清IEF及免疫印跡檢測(cè)ApoE表型，亦取得較好效果。