《組織學(xué)與胚胎學(xué)》 （四）免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)

免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）術(shù)是應(yīng)用抗原與抗體結(jié)合的免疫學(xué)原理，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。這種方法特異性強(qiáng)，敏感度高，進(jìn)展迅速，應(yīng)用廣泛，成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)眾多學(xué)科的重要研究手段。近年隨著純化抗原和制備單克隆抗體的廣泛開(kāi)展以及標(biāo)記技術(shù)不斷提高，免疫細(xì)胞化學(xué)的進(jìn)展更是日新月異，不僅用于許多基本理論的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速診斷等臨床實(shí)際。組織的多肽和蛋白質(zhì)種類繁多，具有抗原性。分離純化人或動(dòng)物組織某種蛋白質(zhì)，作為抗原注入另一種動(dòng)物體內(nèi)，后者即產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體（免疫球蛋白）。從被免疫動(dòng)物的血清中提取出該抗體，再以熒光素、酶、鐵蛋白或膠體金標(biāo)記，用這種標(biāo)記抗體處理組織切片或細(xì)胞，標(biāo)記抗體即與細(xì)胞的相應(yīng)蛋白質(zhì)（抗原）發(fā)生特異性結(jié)合（圖1-4)。常用的熒光素是異硫氰酸熒光素（FITC)和四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC），在熒光顯微鏡下可觀察熒光抗體抗原復(fù)合物（圖1－5）。常用的酶是辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,從辣根菜中提取的），它的底物是3，3'－二氨基、聯(lián)苯胺（DAB）和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黃色產(chǎn)物，可在光鏡和電鏡下觀察（圖1－6）。鐵蛋白和膠體金標(biāo)記抗體與抗原的結(jié)合，也可在光鏡和電鏡下觀察（圖1－7）。

圖1－6 大鼠腺垂體免疫組織化學(xué)（PAS法）示生長(zhǎng)激素細(xì)胞

（上海醫(yī)科大趙培林教授供圖）

圖1-7 免疫細(xì)胞化學(xué)（蛋白A-膠體金法）和原位雜交術(shù)示大鼠垂體

催乳素細(xì)胞電鏡像 N催乳素細(xì)胞核

↑分泌顆粒內(nèi)顯示金粒

粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）顯示銀粒

（加拿大Douglas醫(yī)院研究中心童毅愛(ài)博士贈(zèng)圖）

標(biāo)記抗體民被檢抗原的結(jié)合方式有兩種。一是直接法，即如上述用標(biāo)記抗體與樣品中的抗原直接結(jié)合（圖1－8）。這種方法操作簡(jiǎn)便，但敏感度不及間接法。間接法是將分離的抗體（第一抗體簡(jiǎn)稱一抗）再作為抗原免疫另一種動(dòng)物，制備該抗體（抗原）的抗體（第二抗體簡(jiǎn)稱二抗），再以標(biāo)記物標(biāo)記二抗。先后以一抗和標(biāo)記二抗處理樣品，最終形成抗原一抗－標(biāo)記二抗復(fù)合物（圖1－8）。間接法中的一個(gè)抗原分子可通過(guò)一抗與多個(gè)標(biāo)記二抗相結(jié)合，因此它的敏感度較高，而且目前國(guó)內(nèi)外均有多種標(biāo)記二抗商品供應(yīng)，使用方便。間接法中較常用的是一種稱之為過(guò)氧化物酶－抗過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法），該法除需一抗和二抗外，還需制備HRP標(biāo)記的抗酶抗體，即以HRP作為抗原免疫動(dòng)物，制成抗HRP抗體，再以HRP標(biāo)記該抗體制成由3個(gè)酶分子與2個(gè)抗酶抗體組成的相當(dāng)穩(wěn)定的環(huán)形PAP復(fù)合物。標(biāo)本先后以一抗、二抗和PAP復(fù)合物處理后，再以DAB顯色，即可檢測(cè)抗原的分布。此法由于細(xì)胞內(nèi)的抗原通過(guò)抗體的層層放大而與多個(gè)酶分子結(jié)合，因此敏感性很強(qiáng)（圖1－9）。

圖1－8 免疫細(xì)胞化學(xué)直接法（A）與間接法（B）示意圖

圖1－9 免疫細(xì)胞化學(xué)PAP法示意圖

免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)近10年來(lái)又有新進(jìn)展，如生物素－親合素等新穎試劑的應(yīng)用，為檢測(cè)微量抗原、受體、抗體開(kāi)辟了新途徑。生物素（biotin）又稱維生素H，是從卵黃和肝中提取的一種小分子物質(zhì)（分子量244.31）；親合素（avidin）又稱卵白素，是從卵白中提取的一種糖蛋白（分子量68kD）。每個(gè)親合素分子有生物素結(jié)合的4個(gè)位點(diǎn)，二者可牢固結(jié)合成不可逆的復(fù)合物。生物素－親合素的應(yīng)用大致有三種方法。①標(biāo)記親合素－生物素法（labelled avidin- biotin method,LAB法）：將親合素與標(biāo)記物（HRP）結(jié)合，一個(gè)親合素可結(jié)合多個(gè)HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結(jié)合，一個(gè)抗體分子可連接多個(gè)生物素分子，抗體的活性不受影響。細(xì)胞的抗原（或通過(guò)一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將標(biāo)記親合素結(jié)合在抗體的生物素上，如此多層放大提高了檢測(cè)抗原的敏感性（圖1－10）。②橋連親合素－生物素法（bridged avidin-biotin method,BAB法)：先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親合素將生物素化的抗體與酶標(biāo)生物素搭橋連接，也達(dá)到多層放大效果（圖1－10）。③親合素－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法）；此法是前兩種方法的改進(jìn)，即先按一定比例將親合素與酶標(biāo)生物素結(jié)合在一起，形成親合素－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC復(fù)合物），標(biāo)本中的抗原先后與一抗、生物素化二抗、ABC復(fù)合物結(jié)合，最終形成晶格樣結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，其中網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，從而大大提高了檢測(cè)抗原的靈敏度（圖1－10）。現(xiàn)有配制現(xiàn)成的ABC藥盒商品供應(yīng)，操作簡(jiǎn)便，是目前廣泛應(yīng)用的一種方法。

圖1－10 生物素－親合素免疫細(xì)胞化學(xué)示意圖

（1）標(biāo)記親合素－生物素法

（2）橋連親合素－生物素法

（3）親合素－生物素－過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（ABC法）