《醫(yī)學免疫學》 二、限制酶切片段長度多態(tài)性組織配型法

迄今，一直是血清學和細胞學方法進行HLA抗原結(jié)構(gòu)分析，最近已開始應(yīng)用分子生物學基因克隆技術(shù)進行HLA定型。由于人們已常握了HLA共同和特異的抗原的核苷酸序列，才有可能用此新方法進行組織配型檢驗。

限制酶切片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）組織配型技術(shù)的原理是目前已掌握了編碼HLA抗原的核苷酸序列，包括各等位基因共有的和專有的序列。HLA-A、-B、-C位點的Ⅰ類重鏈基因的核苷酸序列有高度同源性，由這些基因片段克隆可得HLAⅠ類專用的探針，因為檢測HLAⅠ類抗原序列的標志，目前也已得到Ⅱ類抗原特異的探針。由于HLA等位基因的多態(tài)性是表現(xiàn)在其核苷酸序列的差異上，由這些基因中克隆出的特異DNA片段，就可檢測這些基因的差別。由于核苷酸序列不同，被限制性內(nèi)切酶作用部位（切點）也不同，這種酶切點只有4～6個核苷酸長度。因此來源于不同HLA單倍型的DNA可被一種內(nèi)切酶切成不同長度的片段。在實際工作中，從細胞中提取基因組DNA（genomic DNA）的多態(tài)性比實際HLA-Ⅱ類抗原的多態(tài)性還要復(fù)雜，因為基因的內(nèi)含子（不轉(zhuǎn)錄基因）序列不同，和外顯子（轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)）序列差別均在酶切后的細胞總DNA中。

RFLP組織配型檢測主要包括4個步聚（印跡）：①提取細胞總DNA，用限制性內(nèi)切酶消化；②凝膠電泳；③將凝膠中分離好的DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜上；④經(jīng)變性處理后用同位素標記的探針進行分子雜交。經(jīng)放射自顯影，得到顯影帶（bands）。即可得知分子量大小不同的DNA片段（圖20-9）。

圖20－9用RFLP進行組織定型比較三個標本的組織定型

RFLP組織配型實驗是用于血清學或細胞學檢測失敗的樣品，如HLA抗原不表達（裸細胞）細胞脆性大而破碎，淋巴細胞減少沒有足夠的樣品時。由于分子生物學方法采樣少、特異、敏感的優(yōu)點可彌補常規(guī)方法的不足。此外，RFLP組織配型法還可查出DNA變異及基因重組的情況，而血清學方法則不能。PFLP組織配型為器官移植、骨髓移植選擇適宜的供體，用比較供體，受體限制酶切片段的長度的差異。兩者的RFLP越接近。差別越小，移植效果越好，近年來發(fā)展的PCR-RFLP以其簡單、敏感、可靠、價廉且無需同位素等優(yōu)點，已取代了RELP法。