Caco-2細胞模型助力新藥研發(fā)

現(xiàn)代藥物研發(fā)成功與否，與藥物的代謝特性密切相關。目前，人工合成和篩選有限數(shù)量的化合物已被大規(guī)模的化合物合成和高通量篩選所取代。無論是開發(fā)新藥還是開發(fā)新的給藥途徑，化合物在體內的吸收特性都非常重要。以往傳統(tǒng)的體內藥代吸收篩選模型，由于所需藥物量大、難以批量化、耗時長以及費用高等弊端，已經無法滿足現(xiàn)代新藥的研發(fā)要求，因而開發(fā)新的快速、準確以及需藥量少的藥物吸收篩選模型已成為新藥研發(fā)的必然趨勢。目前，被廣泛采用的三種篩選方法是：大鼠原位單次灌注法、大鼠外翻腸囊法以及體外人結腸腺癌（Caco-2）細胞系法。其中，Caco-2細胞模型已經成為一種預測藥物人體小腸吸收以及研究藥物轉運機制的標準體外篩選工具。

結構與功能決定其應用價值

Caco-2細胞模型是最近十幾年來國外廣泛采用的一種研究藥物小腸吸收的體外模型，具有相對簡單、重復性較好、應用范圍較廣的特點。其來源于人的直腸癌，結構和功能類似于人小腸上皮細胞，并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系。在細胞培養(yǎng)條件下，生長在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上的細胞可融合并分化為腸上皮細胞，形成連續(xù)的單層，這與正常的成熟小腸上皮細胞在體外培育過程中出現(xiàn)反分化的情況不同。細胞亞顯微結構研究表明，Caco-2細胞與人小腸上皮細胞在形態(tài)學上相似，具有相同的細胞極性和緊密連接。胞飲功能的檢測也表明，Caco-2細胞與人小腸上皮細胞類似，這些性質可以恒定維持約20天。由于Caco-2細胞性質類似小腸上皮細胞，因此可以在這段時間進行藥物的跨膜轉運實驗。

另外，存在于正常小腸上皮中的各種轉運系統(tǒng)、代謝酶等在Caco-2細胞中大都也有相同的表達，如細胞色素P450同工酶、谷氨酰胺轉肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶、葡萄糖醛酸酶及糖、氨基酸、二肽、維生素B12等多種主動轉運系統(tǒng)在Caco-2細胞中都有與小腸上皮細胞類似的表達。由于其含有各種胃腸道代謝酶，因此更接近藥物在人體內吸收的實際環(huán)境。

研究藥物小腸吸收的標準工具

利用人小腸上皮Caco-2細胞單層來進行藥物小腸吸收的細胞水平實驗，現(xiàn)在已經成為一種預測藥物在人體小腸吸收以及研究藥物轉運機制的標準篩選工具。

評價新藥的吸收。在研究新的抗生素藥物時，如新藥為水溶性很差的化合物，則藥物性質決定其不能制作成注射劑。為了改善其口服吸收生物利用度，國外研究人員使用了一些吸收增強劑，用Caco-2細胞來評價其吸收程度取得較好的結果。

還有研究者使用Caco-2細胞模型評價了系列難溶性藥物磷酸酯前藥與其母藥的吸收度，這些藥物包括可的松、苯妥英等。結果發(fā)現(xiàn)，苯妥英等藥物磷酯化后吸收大為增加，而可的松磷酯化后吸收程度有顯著改變，這些結果在其他模型上也類似。在研究藥物賦形劑對藥物吸收的影響時，同時使用了Caco-2細胞模型和大鼠離體腸道進行評價，兩模型的結果一致。這些都表明Caco-2細胞模型在新藥吸收評價方面的重要價值。

預測吸收過程中的藥物相互作用。Caco-2細胞中存在有與小腸上皮相同的各種轉運系統(tǒng)、代謝酶，因此可以用來作為研究與吸收相關的藥物相互作用的體外模型。

小腸上皮的代謝、受體介導的轉運、p-gP對藥物分子的泵出，是一個飽和過程。聯(lián)合用藥時，因為有可能存在藥物競爭酶、載體或p-gP泵的作用，所以會與單獨給藥時的生物利用度存在差異。這種藥物吸收過程中存在的相互作用可以應用Caco-2細胞模型進行研究。此外，與藥物吸收有關的相互作用還可來源于代謝酶、載體、p-gP泵被特定藥物重復給藥引起的誘導。當藥物經細胞轉運途徑被吸收時，p-gP泵成為藥物吸收的一個重要生化屏障，它把進入細胞內的藥物泵出，從而減少了藥物的吸收，因此成為口服藥物生物利用度低、波動大的一個重要影響因素。具有這種p-gP泵出性質的藥物分子在與p-gP泵抑制劑共同口服給藥時，其透過細胞膜吸收的程度增強。

研究吸收機制。Caco-2細胞除了在吸收評價方面的大量應用外，也比較適合用于吸收機制的研究。有研究人員分別利用Caco-2細胞作為鈉和鐵吸收的模型細胞，結果發(fā)現(xiàn)，LR(lipidraft)在決定PI3K/AKT2信號轉導過程中起到重要作用，包括增加了腸道的Na吸收。

拓展藥物小腸代謝研究

人體小腸中存在著豐富的細胞色素P450同工酶，其中P4503A4占到該組織中所有細胞色素P450同工酶的約50％，而其在Caco-2細胞單層中的表達已見報道。

與人體小腸甚至空腸微粒體相比，Caco-2細胞中的細胞色素P450同工酶為低水平表達，這是限制其作為口服給藥化合物的小腸一相代謝研究模型的一個因素。為了克服這一局限，國外研究人員等利用1α，25-二羥基維生素D3處理過的Caco-2細胞單層作為研究小腸代謝動力學首過作用的體外模型。當將該系統(tǒng)應用于研究細胞色素P4503A4底物咪唑安定的代謝動力學時，顯示出與體內研究相似的結果。

盡管細胞色素P450同工酶在Caco-2細胞中的表達水平較低，但其他許多藥物代謝酶的表達水平不經誘導就可以用于藥物小腸代謝的研究。比如，像羧酸酯酶、葡萄糖醛酸轉移酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、磺基轉移酶和兒茶酚-O-甲基轉移酶等在Caco-2細胞中仍保持其功能特點。在這些酶中，二相磺基轉移酶和葡萄糖醛酸轉移酶對于口服給藥化合物的生物利用度尤其重要，因為具有藥理活性的化合物與它們發(fā)生結合反應后通常會導致活性降低或消失。例如，人們已經發(fā)現(xiàn)在Caco-2細胞中，類黃酮物質5，7-二羥黃酮產生硫酸鹽和葡(萄)糖苷酸的變化，5，7-二羥黃酮硫酸鹽的產生速度是其葡(萄)糖苷酸化的兩倍。類似研究也表明，Caco-2細胞模型中酶的表達可以使其應用于藥物的小腸代謝研究。

盡管Caco－2細胞模型尚存在不足，如細胞培養(yǎng)時間過長（21天）；該模型本身為純細胞系，缺乏在小腸上皮細胞中的黏液層；缺少細胞培養(yǎng)標準以及試驗操作標準，使結果有時缺乏可比性；由于Caco-2細胞來源于人結腸，因而該細胞的轉運特性、酶的表達以及跨膜電阻相對更能反映結腸細胞而非小腸細胞等等。但是，不可否認的是，建立與應用Caco－2細胞模型可以被認為是藥物吸收研究方面取得的重要成就，而且隨著改進細胞模型的建立和培養(yǎng)裝置、檢測設備等新技術的應用，其在新藥研發(fā)中必將發(fā)揮出重要作用。