蛋白質(zhì)組學研究的內(nèi)容、方法及意義

生物有機體的生理活動、病理活動以及藥物的作用主要是通過蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的，然而僅憑目前已知的蛋白質(zhì)根本無法闡明各種復雜的生命活動過程，因此，以基因組的研究成果為基礎，以各種先進技術為支撐，進一步研究生物有機體的全部蛋白質(zhì)結構、功能及其相互作用已經(jīng)成為必然。目前大量工作者致力于蛋白質(zhì)組學的研究，本文現(xiàn)對此作一簡述。

1.蛋白質(zhì)組學的定義及研究內(nèi)容

蛋白質(zhì)組學(Proteomics)是研究在特定時間或環(huán)境下某個細胞或某種組織的基因組表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學的真正含義在于：它不是按照傳統(tǒng)的方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子的功能，而是應用各種蛋白質(zhì)組學技術研究某種蛋白質(zhì)在復雜的細胞環(huán)境中的功能。蛋白質(zhì)組學旨在列出全部蛋白質(zhì)的細目，弄清每一個蛋白質(zhì)的結構和功能及蛋白質(zhì)群體內(nèi)的相互作用，對比在疾病和健康狀態(tài)下它們的表達水平的變化。

蛋白質(zhì)組學分為表達蛋白質(zhì)組學和細胞圖譜蛋白質(zhì)組學。前者利用各種先進技術研究蛋白質(zhì)表達的整體變化，即研究在機體的生長發(fā)育、疾病和死亡的不同階段中，細胞與組織的蛋白質(zhì)組分的變化；后者主要通過分離蛋白質(zhì)復合物系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)間的相互作用。

2.蛋白質(zhì)組與基因組的關系

基因是遺傳信息的攜帶者，蛋白質(zhì)則是生命活動的執(zhí)行者。實際上每一種生命運動形式，都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時間和空間出現(xiàn)并發(fā)揮功能的結果。因而蛋白質(zhì)組研究是我們理解細胞功能和疾病發(fā)生發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。如果不能共同致力于蛋白質(zhì)組的研究，那么基因組的研究成果將無法兌現(xiàn)。

ＤＮＡ序列所提供的信息僅僅是一種靜止的資源，而細胞的生命活動是通過各種蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的一種動態(tài)過程。一個機體內(nèi)所有不同的細胞都共享同一基因組，然而同一個機體的不同細胞和不同組織卻有不同的蛋白質(zhì)組，而且機體在不同發(fā)育階段，直至最后消亡的全過程中蛋白質(zhì)組也在不斷變化。因而蛋白質(zhì)組要比基因組復雜得多。由于對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的選擇性剪切、翻譯起止點的變化或者ｍＲＮＡ上三聯(lián)體密碼發(fā)生移碼突變等均可以明顯促進蛋白質(zhì)多樣性的產(chǎn)生，而且ｍＲＮＡ的水平并不能反映蛋白質(zhì)水平，即使一個開放閱讀框(ＯＲＦ)呈現(xiàn)在面前，也根本無法證實某種蛋白質(zhì)存在與否。此外，蛋白質(zhì)在細胞中的位置、穩(wěn)定性的變化，以及與不同的物質(zhì)如其它蛋白質(zhì)、核酸、脂類等配基相結合，再加上蛋白質(zhì)具有多種修飾形式，如糖基化、磷酸化、乙?；?、硫酸化、連接在各種載體上，如小的泛素蛋白等，所有這些均可導致蛋白質(zhì)組要比基因組復雜多個數(shù)量級，同時也說明基因的存在和多樣性與蛋白質(zhì)的存在和多樣性之間是不均衡的。因此，利用基因組的研究成果進行大規(guī)模的蛋白質(zhì)組研究已經(jīng)成為必然。

人類基因組測序成功為蛋白組研究奠定了良好基礎。例如，金黃色葡萄球菌病原體的全套基因組測序已經(jīng)完成，通過基因組的信息來研究其蛋白質(zhì)組成將有助于發(fā)現(xiàn)新的抗癌因子、抗生素、工業(yè)催化劑等；1995年流感嗜血桿菌全部基因組測序完成，為支氣管感染的研究提供了蛋白質(zhì)組學基礎，這些工作將會是蛋白質(zhì)組學的重要組成部分。

3.蛋白質(zhì)組的研究方法

蛋白質(zhì)組研究需要有足夠的技術支撐，如質(zhì)譜分析(ＭＳ)，酵母雙雜交系統(tǒng)，蛋白質(zhì)微陣列技術以及能夠進行大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計算機系統(tǒng)和軟件等[6]?，F(xiàn)階段蛋白質(zhì)組的研究可分為3個主要步驟：應用雙向凝膠電泳、“雙向”高效柱層析分離蛋白質(zhì)；應用氨基酸組成分析、Ｃ或Ｎ末端氨基酸序列分析及質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì)；應用生物信息學數(shù)據(jù)庫對鑒定結果進行存儲、處理、對比和分析。

3.1　雙向凝膠電泳　雙向凝膠電泳(two-dimensionalpolycacrylamidegelelectrophoresis，2-D電泳)是分離蛋白質(zhì)最基本的工具。其原理是：第一向是等電聚集電泳：用ｐＨ值呈梯度排列的凝膠，分離等電點不同的蛋白質(zhì)。第二向是十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPEGE)：由于帶負電荷的SDS可與蛋白質(zhì)多肽鏈結合，掩蓋了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，故可分離分子量不同的蛋白質(zhì)。

雙向凝膠電泳不僅用于蛋白質(zhì)的分離，同時也用于蛋白質(zhì)的純化，一張凝膠可分離純化出幾千個甚至上萬個蛋白質(zhì)。目前美國的Proteome公司已開發(fā)了一種全自動化的儀器，灌腔、電泳、染色全部實現(xiàn)自動化。

雙向凝膠電泳技術存在的問題是不易分離極酸或極堿、極大(>200kD)或極小(<10kD)的蛋白質(zhì)，不易檢測低拷貝(<1000拷貝)蛋白質(zhì)或難溶解蛋白質(zhì)。此外，還有三種新的方法可以用作對2Ｄ電泳的補充：帶有同位素的親和性標簽標記法，二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測量

法，毛細管區(qū)帶電泳。

3.2　“雙向”高效柱層析　“雙向”高效柱層析原理：第一向用分子篩柱層析，按蛋白質(zhì)不同分子量進行分離；第二向用反向柱層析，利用蛋白質(zhì)表面疏水性質(zhì)進行分離。第二向的分離原理與雙向凝膠電泳中利用蛋白質(zhì)等電點分離完全不同，因此兩種方法可相互補充。

雙向高效柱層析的優(yōu)點：(1)可分離得到較多的蛋白量以供鑒定；(2)可與質(zhì)譜分析聯(lián)用，分離流出的蛋白峰直接進入質(zhì)譜儀進行鑒定。

3.3　氨基酸組成分析　氨基酸組成分析可提供蛋白質(zhì)一級結構信息。原理是用酸水解蛋白質(zhì)，測定蛋白質(zhì)中各氨基酸所占摩爾百分數(shù)(%)或各氨基酸的摩爾比率，與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)的理論值進行比較。氨基酸組成分析經(jīng)濟、快速，但靈敏度低。

3.4　Ｃ-或Ｎ-端氨基酸序列分析?。?端氨基酸序列分析常用Edman降解法測定蛋白質(zhì)Ｎ端氨基酸序列，Ｃ端氨基酸序列分析常用羧肽酶法、化學降解法測定蛋白質(zhì)Ｃ端氨基酸序列。目前均可用自動測序儀。

Ｎ-端4個氨基酸殘基序列即可鑒定43%～83%蛋白質(zhì)、Ｃ-端5個氨基酸殘基序列即可鑒定74%～97%蛋白質(zhì)，若兩者結合使用，判斷結果的準確性會更高。

3.5　質(zhì)譜分析　以往ＭＳ僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術的出現(xiàn)，如：介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的Ｍ/Ｚ值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。

質(zhì)譜技術主要用于檢測雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量，也可用于蛋白質(zhì)高級結構及蛋白質(zhì)間相互作用等方面的研究。三條肽段的精確質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì)。

近年來，串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛，其數(shù)據(jù)采集方面的自動化程度、檢測的敏感性及效率都大大提高，大規(guī)模數(shù)據(jù)庫和一些分析軟件(如：SEQUEST)的應用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進行更大規(guī)模的測序工作。目前，利用2Ｄ電泳及ＭＳ技術對整個酵母細胞裂解產(chǎn)物進行分析，已經(jīng)鑒定出1484種蛋白質(zhì)，包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì)。

3.6　酵母雙雜交系統(tǒng)　對于研究蛋白質(zhì)間的相互作用，酵母雙雜交系統(tǒng)是非常有力的工具。其基本原理是：由于所有真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子都由兩部分獨立的功能域組成，即ＤＮＡ結合功能域(ＤＮＡＢＤ)和激活功能域(ＡＤ)。ＤＮＡＢＤ的作用是與特異的啟動子結合，ＡＤ的作用是引導ＲＮＡ聚合酶Ⅱ復合物，兩者靠近并協(xié)同作用，才能使ＤＮＡ結合位點下游的基因得以轉(zhuǎn)錄。如果將待測蛋白之一與ＤＮＡＢＤ融合，蛋白之二與ＡＤ融合，若待測的兩種蛋白有相互作用，則ＤＮＡＢＤ和ＡＤ靠近并激活報道基因的轉(zhuǎn)錄，借此可研究蛋白質(zhì)間的相互作用。

為了大規(guī)模高通量研究蛋白間的相互作用，近年來發(fā)展了一種酵母雙雜交掃描法。首先建立兩類含不同ｃＤＮＡ文庫的酵母菌株，在第一類菌株中，讀碼框(ＯＲＦ)以ＤＮＡＢＤ融合蛋白形成被表達，在第二類菌株中，ＯＲＦ以ＡＤ融合蛋白形式被表達，將兩類菌株配對，用缺陷的培養(yǎng)基篩選二倍體，只有表達兩種可以相互作用的蛋白質(zhì)的酵母細胞才可以在該培養(yǎng)基上生長。

該方法的應用模式有兩種：一種是微陣列模式，即先將第一類酵母菌(表達已知蛋白-ＤＮＡＢＤ融合蛋白)克隆在陣列的柵狀網(wǎng)孔內(nèi)，以此篩查第二類菌株(表達待測蛋白ＡＤ融合蛋白)，從而確定待測蛋白質(zhì)可與哪一已知蛋白質(zhì)相結合；另一種是庫篩查模式，即先將一組ＯＲＦ產(chǎn)生的融合蛋白建成一個庫，而后通過待測蛋白質(zhì)與庫中的蛋白質(zhì)的反應尋找可以相互作用某個或某些蛋白質(zhì)。

最近，從酵母雙雜交系統(tǒng)衍生出一種新的方法，稱為“反向雙雜交”，主要用于鑒定可以干擾蛋白質(zhì)間相互作用的化合物和多肽。與傳統(tǒng)方式不同，這種方法可以用于開發(fā)在體內(nèi)具有活性的藥物。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)的作用已經(jīng)擴展至對蛋白質(zhì)的鑒定，通過這種方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與酵母菌ｍＲＮＡ剪接相關的15種蛋白質(zhì)，以及噬菌體Ｔ7的55種蛋白質(zhì)、痘苗病毒的226種蛋白質(zhì)、釀酒酵母的5345種蛋白質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)提供的蛋白質(zhì)間可能的相互作用的信息，還需通過進一步的生物化學試驗加以確定和排除。

3.7　微陣列技術　嚴格的講，ＤＮＡ微陣列技術并非蛋白質(zhì)組技術的范疇，但是卻不失為大規(guī)模研究蛋白質(zhì)功能的一種好方法。通常在轉(zhuǎn)錄中受到協(xié)同調(diào)控的基因?qū)⒕幋a同種功能的蛋白質(zhì)，如果某一段ＤＮＡ序列與已知功能的ＤＮＡ序列在很大程度上相同，說明它們編碼的蛋白質(zhì)的功能也可能相同，例如酵母細胞中與細胞分裂周期和芽孢形成相關的基因可能編碼功能相同的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)陣列技術已經(jīng)發(fā)展起來，蛋白質(zhì)樣品以納升小滴共價吸附在玻璃、硅、塑料等載物片上，每一個載物片可以點10000個樣品，可用于鑒定一個生物有機體的全部修飾酶。例如：蛋白質(zhì)微陣列技術已經(jīng)檢測出酵母中近乎全套的蛋白激酶。

3.8　生物信息學　蛋白質(zhì)組的研究要求有自動化處理大規(guī)模數(shù)據(jù)的工具，從而促使生物信息學迅速發(fā)展。目前許多與蛋白質(zhì)組相關的軟件可通過與EXPASY蛋白質(zhì)組學服務器鏈接而獲得(ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｃｈ/ｗｗｗ/ｔｏｏｌｓ.ｈｔｍｌ)，這些軟件可用于鑒定蛋白質(zhì)的種類，分析蛋白質(zhì)的理化特性，預測可能的翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)的三維結構，其中注釋蛋白質(zhì)和二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究的生物信息學核心。

4.蛋白質(zhì)組學與疾病

蛋白質(zhì)組學可以讓我們對人類疾病的發(fā)病機制有更加清楚的認識。在基因水平檢測基因的突變和多態(tài)性，在蛋白質(zhì)水平分析健康及病變組織不同水平的基因表達，對于疾病的發(fā)病機制的研究二者均具有重要意義，但對于疾病的診斷治療方面后者更為重要。正常及患病個體的組織、體液中的蛋白質(zhì)分布、特征及差異都是將蛋白質(zhì)組學技術應用于分子診斷學的基礎。例如：骨髓瘤患者尿液中沉淀物??BenceJones蛋白、抗上皮細胞腫瘤特異性抗體、病變肝細胞中的ｐ53蛋白均可以作為腫瘤的標記，用于腫瘤的診斷。目前，應用蛋白質(zhì)組學技術已發(fā)現(xiàn)許多與癌癥相關的異常糖基化的蛋白質(zhì)，但將這些研究結果應用于臨床診斷其價值尚待評估。

到目前為止，心功能障礙的發(fā)病機制仍未闡明。如果用蛋白質(zhì)組學的研究方法分析心肌蛋白質(zhì)表達的變化，將為闡明心臟疾病相關的細胞病變機制提供新的思路，也將有助于發(fā)現(xiàn)新的診斷標記、治療方法。人類心臟蛋白質(zhì)聯(lián)合二維電泳數(shù)據(jù)庫(ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｃｈ/ｃｈｚｄ/ｚｄｉｎｄｅｘ.ｈｔｍｌ)已建立，目前已鑒定幾百種心臟蛋白質(zhì)。

對于感染性疾病而言，由于許多微生物的部分或全部基因組的測序工作已經(jīng)完成，這將有助于鑒定該微生物所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)，以尋找新的診斷標記，尋找用作疫苗的抗原及毒力決定簇等。

5.蛋白質(zhì)組與藥物開發(fā)

藥物作用的靶標多為蛋白質(zhì)。如何發(fā)現(xiàn)更多的藥物作用的靶蛋白是藥品開發(fā)面臨的主要挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組研究能發(fā)現(xiàn)那些在健康人組織細胞中正常表達或不存在，而在患者組織細胞中異常表達或出現(xiàn)的蛋白質(zhì)，為藥品開發(fā)提供新的藥物靶標，或新的生物標記，還能發(fā)現(xiàn)與藥物毒性相關的蛋白質(zhì)，用于預報藥物的毒副作用，從而減少到臨床試驗階段才發(fā)現(xiàn)該藥物的副作用所造成的中間階段的損耗。

除了藥物作用的靶蛋白的選擇外，觀察藥物對靶蛋白的作用及藥物毒性的研究也同樣重要。在這一研究領域中，可采用CD-標記(CD-tagging)技術研究用藥期間蛋白質(zhì)組中的任一成員在分子和細胞水平的各種變化。其原理是將帶有CD-tagging的CD盒插入某一個表達基因的內(nèi)含子，結果該基因轉(zhuǎn)錄的ｍＲＮＡ增加了一段外來序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)增加了一個特殊的外來肽???抗原決定簇或熒光蛋白，這種外來肽作為標記物，可用高效價的抗體識別或各種熒光檢測方法觀察，標記的基因及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化可用多聚酶鏈反應(ＰＣＲ)、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(ＲＴＰＣＲ)、測序等方法觀察。因此，ＣＤ標記技術可用來研究基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的變化，評估基因的功能狀態(tài)，探查蛋白質(zhì)表達的組織特異性，以及蛋白質(zhì)在細胞或細胞器中的定位，等等。該項技術的特點是：(1)尤其適用于標記內(nèi)含子豐富的基因；(2)被標記的基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及蛋白質(zhì)均保留正常的功能；(3)不影響基因的正常調(diào)控；(4)可在組織細胞原位觀察研究標記基因、標記蛋白；(5)也可從組織細胞中分離提純標記蛋白，然后用于生化、功能檢查。

蛋白質(zhì)組學正日漸走向成熟。相信對于未來醫(yī)學的發(fā)展，無論是基礎、臨床研究，還是藥物開發(fā)，蛋白質(zhì)組學的貢獻都將不可估量。