植物組織培養(yǎng)及其在中草藥研究中的運(yùn)用

植物組織培養(yǎng)（Plant

Tissue Culture）是應(yīng)用無(wú)菌培養(yǎng)的方法培養(yǎng)植物的一個(gè)離體部分，也即是一種將自然環(huán)境中分離出來(lái)的植物細(xì)胞或組織放入含有合成培養(yǎng)基的瓶中，在無(wú)菌條件下使之生長(zhǎng)或發(fā)育的方法。這項(xiàng)工作自動(dòng)控制50年代后期至今巳取得了很大的進(jìn)展，如誘導(dǎo)培養(yǎng)胡蘿卜的體細(xì)胞分化成完整植株，由曼陀羅的花藥培養(yǎng)形成了單倍體的植株。

從而證明了植物每個(gè)體細(xì)胞都有形成整體植物的潛在能力，如植物細(xì)胞具有“全能性”，在離體培養(yǎng)的一定條件下能誘導(dǎo)其分化器官和再生成植株。70年代以后有關(guān)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的研究得到了很訣發(fā)展，如煙草、曼陀羅、顛茄、胡蘿卜、油菜等能從其原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)再生分化長(zhǎng)成胚或完整的植物，利用原生質(zhì)體融合已經(jīng)能使煙草屬和矮牽牛屬的雜種細(xì)胞增殖分化成雜種植株。

因此，運(yùn)用組織培養(yǎng)方法可以在比較簡(jiǎn)單易觀察的條件下研究細(xì)胞、組織或器官的繁殖、生長(zhǎng)和分化，以及各種外界因素對(duì)它們的影響，從而為解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和藥物生產(chǎn)中的某些問(wèn)題開(kāi)辟了廣闊的前景，目前已有若干重要成果應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，一為營(yíng)養(yǎng)繁殖系的快速繁殖，如以甘蔗為例，原來(lái)每畝要用蔗種0.5～1噸，用組織培養(yǎng)快速繁殖的幼苗進(jìn)行栽培可節(jié)省大量蔗種。又如貝母繁殖率非常低，而用組織培養(yǎng)分化出的三個(gè)月左右的鱗莖，其大小就相當(dāng)于用種子繁殖二年生的鱗莖，另一為藥物和生物制品的工業(yè)生產(chǎn)，藥用植物的有效成分一般都從植物體提得，其產(chǎn)量和質(zhì)量難免要受到植物的遺傳性、生長(zhǎng)條件、收獲時(shí)間及貯藏和運(yùn)輸?shù)纫蛩厮绊?，如果能采用?lèi)似培養(yǎng)微生物產(chǎn)生抗菌素的方法生產(chǎn)有效成分，就可克服這些缺點(diǎn)，這對(duì)生長(zhǎng)條件要求嚴(yán)格、生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量低、價(jià)值貴重的植物藥更有意義。如近年來(lái)已大量培養(yǎng)人參組織，并提取有效成分，因此利用組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分，探索天然藥物生產(chǎn)工業(yè)化的途徑是當(dāng)前藥物生產(chǎn)的一個(gè)新方向，隨著大規(guī)模人工培養(yǎng)技術(shù)的成功，就有可能用組織培養(yǎng)法來(lái)代替全植物提取有效成分，這項(xiàng)工作將是未來(lái)研究植物藥的中心課題之一。

培養(yǎng)基的組成和配制法培養(yǎng)條件

材料和方法有效成分的形成

一、培養(yǎng)基的組成和配制法

近年來(lái)用的化學(xué)合成培養(yǎng)基大致由6種成分組成：（1）糖類(lèi)，②多種無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，（3）微量元素，（4）氨基酸、酰胺、嘌呤：（5）維生素；③生長(zhǎng)素。此外，有些培養(yǎng)基還可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麥芽浸出液等，培養(yǎng)基中如加入0．5～1％的瓊脂即為靜止培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，否則為懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。不同植物材料常需要改變配方，如維持生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和分化的培養(yǎng)基配方就不同，因此配方的種類(lèi)很多，目前以Ms （Murashige

and

Skoog）培養(yǎng)基配方為最常用的一種基本培養(yǎng)基，它利于一般植物組織和細(xì)胞的快速生長(zhǎng)。

總之，在進(jìn)行組織培養(yǎng)研究時(shí)應(yīng)根據(jù)研究目的和培養(yǎng)植物的種類(lèi)來(lái)確定培養(yǎng)基的組成，除營(yíng)養(yǎng)、誘導(dǎo)作用外還應(yīng)當(dāng)注意離子平衡和毒性問(wèn)題，如水一般都采用重蒸餾水，無(wú)機(jī)鹽類(lèi)一般都需用化學(xué)純的藥品，

pH值可用1N

KoH（或NaOH）溶液和2N

HCI調(diào)整。有時(shí)可以用普通藥品代替，但須注意這些藥品不僅應(yīng)有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還須無(wú)毒。如果在工業(yè)上使用大缸深層培養(yǎng)細(xì)胞或組織生產(chǎn)有效成分和生物制品、應(yīng)用培養(yǎng)基的量將要以噸位計(jì)量時(shí)，則采用什么代用品較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用更應(yīng)慎重考慮。

二、培養(yǎng)條件

（一）溫度：對(duì)大多數(shù)植物組織20～28℃即可滿足生長(zhǎng)所需，其中26～27℃最適合。

（二）光：

組織培養(yǎng)通常在散射光線下進(jìn)行。光的影響可導(dǎo)致不同的結(jié)果。有些植物組織在暗處生長(zhǎng)較好，而另一些植物組織在光亮處生長(zhǎng)較好，但由愈傷組織分化成器官時(shí)，則每日必須要有一定時(shí)間的光照才能形成芽和根。有些次生物質(zhì)的形成，光是決定三因素。

（三）滲透壓：

滲透壓對(duì)植物組織的生長(zhǎng)和分化很有關(guān)系。在培養(yǎng)基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質(zhì)可以調(diào)整滲透壓。通常1～2個(gè)大氣壓可促進(jìn)植物組織生長(zhǎng)，2個(gè)大氣壓以上時(shí)，出現(xiàn)生長(zhǎng)障礙，6個(gè)大氣壓時(shí)植物組織即無(wú)法生存。

（四）酸堿度：一般植物組織生長(zhǎng)的最適宜pH為5～6．5。在培養(yǎng)過(guò)程中pH可發(fā)生變化，加進(jìn)磷酸氫鹽或二氫鹽，可起穩(wěn)定作用。

（五）通氣：

懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞的旺盛生長(zhǎng)必須有良好的通氣條件。小量懸浮培養(yǎng)時(shí)巨常轉(zhuǎn)動(dòng)或振蕩，可起通氣和攪拌作用。大量培養(yǎng)中可采用專(zhuān)門(mén)的通氣和攪拌裝置。

三、材料和方法

從低等的藻類(lèi)到苔蘚、蕨類(lèi)、種子植物等高等植物的各類(lèi)、各部分都可采用作為組織培養(yǎng)的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韌皮部細(xì)胞，被子植物采用胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉、花藥、花粉、子房和胚珠等各個(gè)部分。

由于植物在自然條件下，表面常被霉菌和細(xì)菌污染，故材料必須進(jìn)行滅菌處理。一般用漂白粉溶液（1～10％）、次氯酸鈉溶液（0．5～10％）、升汞溶液（0．01％）、乙醇（70％）或過(guò)氧化氫（3～10％）等處理后，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗至凈，然后在無(wú)菌室內(nèi)，將所取的組織迅速培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上。在適宜的條件下，受傷組織切口表面不久即能長(zhǎng)出一種脫分化的組織堆塊，稱(chēng)為愈傷組織（Callus），此種愈傷組織在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上經(jīng)一定時(shí)間即能誘導(dǎo)生長(zhǎng)成整株植物，因此愈傷組織既可是某種植物代謝產(chǎn)物的來(lái)源，又是誘導(dǎo)成株的主要途徑之一。

在適宜的培養(yǎng)條件下，還可使愈傷組織長(zhǎng)期傳代生存下去，這種培養(yǎng)稱(chēng)為繼代培養(yǎng)。但在繼代培養(yǎng)中，不少植物培養(yǎng)的組織或細(xì)胞隨著再培養(yǎng)代數(shù)的增加，分化能力就逐漸降低甚至喪失，其原因可能是由于在培養(yǎng)過(guò)程中原有母體中存在的、與器官形成有關(guān)的特殊物質(zhì)被逐漸消耗所致，因此可以用激素或改善營(yíng)養(yǎng)條件使之恢復(fù)，也有認(rèn)為是組織和細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)中遺傳往的改變，主要是染色體的變化，出現(xiàn)大量多倍性或非整倍性細(xì)胞，這種改變恢復(fù)的可能住較小。不同的培養(yǎng)基可以使愈傷組織具有不同的生長(zhǎng)速度，結(jié)構(gòu)也可松可緊，利用這些特性可使之分散成為單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)。要形成單細(xì)胞培養(yǎng)宜在較高鹽分、高生長(zhǎng)素及高水解酪蛋白的培養(yǎng)基中進(jìn)行，然后移入液體并經(jīng)攪拌而分散成單細(xì)胞。也有用加入一些果膠酶的辦法，但一般來(lái)說(shuō)要得到純一的單細(xì)胞是很少的。

在培養(yǎng)藥用植物選材時(shí)，還應(yīng)考慮到所需要的次生物質(zhì)在植物體中的合成部位，如果選材和培養(yǎng)方法適當(dāng)，可使原植物內(nèi)所產(chǎn)主的代謝物通過(guò)細(xì)胞或組織培養(yǎng)發(fā)生生化轉(zhuǎn)變而獲得。

通過(guò)組織培養(yǎng)可獲得有效成分，但實(shí)際上只有大量培養(yǎng)成功才有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此在生產(chǎn)上常采用懸浮培養(yǎng)法來(lái)代替含有瓊脂的固體培養(yǎng)基。愈傷組織懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)通常比靜止培養(yǎng)快，這是由于懸浮培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)成分可較快地滲入細(xì)胞，抑制生長(zhǎng)的代謝廢物可較快地除去，同時(shí)供氧情況也較好，在進(jìn)行這種培養(yǎng)時(shí)要注意通氣與定期更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，這是保證生長(zhǎng)穩(wěn)定，次生物質(zhì)產(chǎn)量高的關(guān)鍵之一。

四、有效成分的形成

列舉用組織培養(yǎng)方法合成的一些有效成分。

利用組織培養(yǎng)方法產(chǎn)生藥用成分，已漸漸成為藥物生產(chǎn)的新方向之一。六十年代以來(lái)，有些國(guó)家已經(jīng)開(kāi)展了薯蕷及其他有關(guān)科屬植物的組織培養(yǎng)，研究薯蕷皂甙元的形成，探討其生物合成機(jī)制；已知有7種薯蕷屬植物經(jīng)組織培養(yǎng)后，可獲得薯蕷皂甙元或其它甾體化合物，其中三角葉薯蕷Dioscorea deltoides Wal1。經(jīng)組織培養(yǎng)得到薯蕷皂甙元的含量為0．3～2．5％，此外尚有魚(yú)藤酮、甘草甜素，菸堿等，例如從煙草根尖細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可產(chǎn)生2．9％（干重）菸堿。

在通常應(yīng)用的基本培養(yǎng)基中適當(dāng)添加生長(zhǎng)激素、維生素或其他化學(xué)藥品有時(shí)能使代謝物增加，如白花曼陀羅組織培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中加進(jìn)0．1％酪氨酸可使阿托品的產(chǎn)量增加7倍多，蕓香組織培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中添加4一羥基-2喹啉酚，可促進(jìn)白蘚堿的合成和積累，在這兩例中的添加物被認(rèn)為是生物合成的前體。又如培養(yǎng)三分三愈傷組織時(shí)，在生長(zhǎng)后期供給1my/1激動(dòng)素，可使東莨菪堿的含量達(dá)到0．495％，比原植物中的含量提高很多。

除了培養(yǎng)基的組成外，環(huán)境因素也影響次生物質(zhì)的產(chǎn)生。例如石芹的組織培養(yǎng)在黑暗中雖也增殖，但不形成黃酮類(lèi)，而當(dāng)暴露于光線中時(shí)，就能測(cè)出芹菜甙。組織培養(yǎng)應(yīng)用在藥學(xué)方面的工作雖然歷史不長(zhǎng)，但發(fā)展很迅速，它具有如下一些優(yōu)點(diǎn)：

1．利用組織培養(yǎng)代替原植物的栽培以獲得所需的有效成分，達(dá)到產(chǎn)量高，成本低的目的，還可節(jié)約土地。

2．除了應(yīng)用于產(chǎn)生次生物質(zhì)外，還可應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化。例如煙草組織培養(yǎng)中蒂巴因去甲基后可能生成嗎啡。

3．從組織培養(yǎng)的定性分析中發(fā)現(xiàn)新化合物。例如在蕓香組織培養(yǎng)中，合成和積累了蕓香素（Rutacultin），它是一個(gè)至今尚未能從原植物或其他植物的呋喃香豆精中檢測(cè)到的化合物。因而，組織培養(yǎng)將是獲得新的生物活性化合物的一個(gè)來(lái)源。

4．一般情況下，組織培養(yǎng)是異養(yǎng)的，但也有自養(yǎng)的細(xì)胞系株，它們具有光合作用的能力而不依賴外界的糖類(lèi)供應(yīng)。這種特性將使細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)越于全植物，并更為經(jīng)濟(jì)。

目前中國(guó)有關(guān)單位已成功地將麥角菌、靈芝、猴頭菇等真菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，高等植物組織培養(yǎng)在工業(yè)化中的應(yīng)用也正在研究。

總之，植物組織培養(yǎng)這一新技術(shù)在中草藥方面應(yīng)用的前途是無(wú)限廣闊的，它不僅有利于探討和闡明藥用植物生理、遺傳和成分生物合成等一系列理論問(wèn)題，而且一旦工業(yè)化生產(chǎn)問(wèn)題得到解決，將可以為防病治病做出很大的貢獻(xiàn)。