《免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)》 第四節(jié)　免疫濁度法

經(jīng)典的沉淀試驗(yàn)有4個缺點(diǎn)無法克服，即操作繁瑣、敏感度低（10～100μg/ml）、時間長和難以自動化。根據(jù)抗原與抗體能在液體內(nèi)快速結(jié)合的原理，70年代出現(xiàn)了微量免疫沉淀測定法，即免疫透射濁度測定、免疫膠乳濁度測定和免疫散射濁度測定法。這3種技術(shù)皆已常規(guī)用于臨床體液蛋白的檢測，并已創(chuàng)造出了多種自動化儀器。

免疫濁度測定的基本原理是：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過量時，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計(jì)算出受檢物的含量。

免疫濁度測定法按照儀器設(shè)計(jì)的不同可以分為兩種，即比濁儀測定（turbidimetermeasure）和散射比濁儀測定（nephelomitermeasure）。比濁儀測定是測量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰減，其讀數(shù)以吸光度A表示。A什反映了入射光與透射光的比率（A＝2－log10T，T代表濁度百分比）。散射比濁儀測定是測量入射光遇到質(zhì)點(diǎn)（復(fù)合物）后呈一定角度散射的光量，該散射光經(jīng)放大后以散射值表示。兩者的比較見圖12-12。

圖12-12透射光和散射光測定比較

由于免疫復(fù)合物的形成有時限變化，當(dāng)抗原抗體相遇后立即結(jié)合成小復(fù)合物（＜19S），幾分種到幾小時才形成可見的復(fù)合物（＞19S）。作為快速比濁測定，這種速度太慢，加入聚合劑（或促聚劑）可中速大的免疫復(fù)合物形成。目前促聚劑多用聚乙二醇（MW6000～8000），濃度約為4％。

濁度測定亦有其弱點(diǎn)。其一是抗原或抗體量大大過剩時易出現(xiàn)可溶性復(fù)合物，造成測定誤差，測定單克隆蛋白時這種更易出現(xiàn)。其二是應(yīng)維持反應(yīng)管中抗體蛋白量始終過剩，這個值要預(yù)先測定，使儀器的測定范圍在低于生理范圍到高于正常范圍之間；其三是受血脂的影響，尤其是低稀釋度時，脂蛋白的小顆?？尚纬蓾岫?，使測定值假性升高。

二、免疫膠乳濁度測定法

在上述比濁法中，少量的小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非放置較長時間；如形成較大的復(fù)合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。于是發(fā)展了免疫膠乳濁度測定，其基本原理是：將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)不阻礙光線透過，兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，當(dāng)然也與待測抗原量呈正比。見圖12-13。

圖12-13載體膠乳免疫比濁原理

（a）帶抗體的膠乳在波長之內(nèi)可透過光線；（b）結(jié)合后，則形成光線衰減

該技術(shù)的關(guān)鍵在于兩個方面。首先是選擇適用的膠乳，其大小（直徑）要稍小于波長。用500nm波長者，選擇100nm顆粒較適合；用585nm波長者，則選用100～200nm顆粒為好。目前多用200nm的膠乳顆粒。其次，膠乳與抗體結(jié)合時用化學(xué)交聯(lián)雖好，但失活也較嚴(yán)重；一般用吸附法即可。

三、免疫速率散射濁度測定法

速率散射比濁法（ratenephelometry）是Sternberg（1977）創(chuàng)建的。光沿水平軸照射時，碰到小顆粒的免疫復(fù)合物可導(dǎo)致光散射，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比，亦即待測抗原越多，形成的復(fù)合物也越多，散射光就越強(qiáng)。

速率散射比濁測定是一種抗原抗體結(jié)合的動態(tài)測定法。經(jīng)典的沉淀反應(yīng)皆在抗原抗體結(jié)合完成后進(jìn)行復(fù)合物的定性或定量測定（終點(diǎn)法）；若在抗原抗體反應(yīng)的最高峰（約在1min內(nèi)）測定其復(fù)合物形成的速率（速率法），則可達(dá)到快速、準(zhǔn)確的目的。