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多肽、甾族激素、藥物、脂肪胺、核苷等小分子物質(zhì)僅能與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，而它們自己并不是免疫原，不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。只有將這種半抗原與蛋白質(zhì)或其他高聚物結(jié)合后才能刺激機體產(chǎn)生抗體。結(jié)合的方法有物理法和化學(xué)法。物理吸附的載體有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫酸葡聚糖、羧甲基纖維素等，是通過電荷和微孔吸附半抗原?；瘜W(xué)法是利用功能團把半抗原以載體上。
（一）載體選擇
1．蛋白質(zhì)類蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子膠體物質(zhì)，是一種良好的載體。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和血藍(lán)蛋白等。其中以牛血清蛋白最為常用，因其溶解度大，免疫活性強，又容易獲得。蛋白質(zhì)和半抗原結(jié)合是通過游離氧基、游離羧基、酚基、巰基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基團的縮合。
2．多肽類聚合物是人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚賴氨酸（polylysine）。這種多聚合物與半抗原結(jié)合后，可誘發(fā)動物產(chǎn)生高滴度、高親和力的抗體。多聚賴氨酸的分子量可達(dá)十幾萬到幾十萬，是良好的載體。
3．大分子聚合物和某些顆粒PVP、羧甲基纖維素和活性碳等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘發(fā)產(chǎn)生良好的抗體。
因半抗原種類、動物類別、載體種類及結(jié)合方法的不同，制得的免疫原對動物免疫所產(chǎn)生的效果也不同。實際應(yīng)用時，應(yīng)多采用幾種載體或方法。
（二）連接方法
半抗原與載體連接要掌握3個基本條件：帶游離氨基或游離羧基以及二種基團皆有的半抗原，如多肽激素類（腦啡肽、胃泌素、ACTH、前列腺素等），它們有游離的氨基或羧基。羧基可用混合酸酐法和碳化二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵。同樣，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。亦可用雙功能試劑如戊二醛、甲苯2，4-二異酸鹽與載體氨基連接。脂肪胺可用碳化二亞胺縮合劑或?qū)ο趸锦Ｂ确磻?yīng)，把脂肪胺變?yōu)閷ο趸锦０罚ㄟ^加氫還原為氨基苯酰衍生物，再用重氮化反應(yīng)。②帶有羥基、酮基、醛基的半抗原，如醇、酚、糖、多糖、核苷以及甾族激素等，它們都不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法在半抗原上引起羧基后才能與載體連接。③芳香族半抗原由于環(huán)上帶有羧基，它鄰位上的氫很活潑，極易取代。
半抗原和載體連接的方法在一般實驗室皆可完成，但反應(yīng)條件應(yīng)嚴(yán)格要求，以防半抗原失活或載體嚴(yán)重變性（一般變性并不妨礙）。
1．碳化二亞胺法碳化二亞胺是一種化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷碾p功能試劑，常用的水溶性碳化二亞胺化學(xué)名為1-乙基-3-（3-二甲氨基）-碳化二亞胺鹽酸鹽。它可與半抗原的羧基、也可與其氨基結(jié)合，反應(yīng)如下：+
此連接方法十分簡便，只需將載體蛋白質(zhì)和抗原按一定比例混合在適當(dāng)?shù)娜芤褐?，然后加入水溶性碳化二亞胺，攪?～2h，置室溫24h，再經(jīng)透析即可。
2．戊二醛法戊二醛也是常用的雙功能交聯(lián)劑，它借兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價鍵連接，其反應(yīng)如下：
蛋白質(zhì)-NH2+半抗原-NH2+COH-(CH2)3-COH→蛋白質(zhì)-N=CH-(CH2)3-CH=N-半抗原
3．氯甲酸異丁酯法該法又稱為混合酸酐法，是利用半抗原上的羧基和載體蛋白上的氨基以肽鏈相連接，方法簡便，多用于類固醇抗原的制備，其反應(yīng)如下：
（三）無羧基和氨基半抗原衍生物的制備
某些類固醇和藥物，需加以適當(dāng)?shù)母脑?，使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然虬被难苌铩Ｒ罁?jù)半抗原的性質(zhì)有如下4種方法。
1．琥珀酸酐法琥珀酸酐是琥珀酸的脫水產(chǎn)物，遇水又可恢復(fù)。如果將帶有羥基的半抗原化合物和琥珀酸酐在無水的吡淀中反應(yīng)，就可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。再經(jīng)碳化二亞胺可氯甲酸異丁酯法，制備載體半抗原。制備衍生物的反應(yīng)如下：
2．O-（羧甲基）羧胺法帶有酮基的半抗原與O-（羧甲基）羥反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌?。反?yīng)式如下：
半抗原-C=O+H2N-O-CH2COOH→半抗原-C=N=O=CH2-COOH
3．一氯醋鈉法帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。其反應(yīng)式如下：
4．重氮的對氨基苯甲酸法先將對氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生再作用于帶有酚基的半抗原，獲得帶有羧基的半抗原衍生物。反應(yīng)式如下：
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多肽、甾族激素、藥物、脂肪胺、核苷等小分子物質(zhì)僅能與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，而它們自己并不是免疫原，不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。只有將這種半抗原與蛋白質(zhì)或其他高聚物結(jié)合后才能刺激機體產(chǎn)生抗體。結(jié)合的方法有物理法和化學(xué)法。物理吸附的載體有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫酸葡聚糖、羧甲基纖維素等，是通過電荷和微孔吸附半抗原?；瘜W(xué)法是利用功能團把半抗原以載體上。
（一）載體選擇
1．蛋白質(zhì)類蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子膠體物質(zhì)，是一種良好的載體。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和血藍(lán)蛋白等。其中以牛血清蛋白最為常用，因其溶解度大，免疫活性強，又容易獲得。蛋白質(zhì)和半抗原結(jié)合是通過游離氧基、游離羧基、酚基、巰基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基團的縮合。
2．多肽類聚合物是人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚賴氨酸（polylysine）。這種多聚合物與半抗原結(jié)合后，可誘發(fā)動物產(chǎn)生高滴度、高親和力的抗體。多聚賴氨酸的分子量可達(dá)十幾萬到幾十萬，是良好的載體。
3．大分子聚合物和某些顆粒PVP、羧甲基纖維素和活性碳等皆可與半抗原結(jié)合，加入福氏完全佐劑可誘發(fā)產(chǎn)生良好的抗體。
因半抗原種類、動物類別、載體種類及結(jié)合方法的不同，制得的免疫原對動物免疫所產(chǎn)生的效果也不同。實際應(yīng)用時，應(yīng)多采用幾種載體或方法。
（二）連接方法
半抗原與載體連接要掌握3個基本條件：帶游離氨基或游離羧基以及二種基團皆有的半抗原，如多肽激素類（腦啡肽、胃泌素、ACTH、前列腺素等），它們有游離的氨基或羧基。羧基可用混合酸酐法和碳化二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵。同樣，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。亦可用雙功能試劑如戊二醛、甲苯2，4-二異酸鹽與載體氨基連接。脂肪胺可用碳化二亞胺縮合劑或?qū)ο趸锦Ｂ确磻?yīng)，把脂肪胺變?yōu)閷ο趸锦０罚ㄟ^加氫還原為氨基苯酰衍生物，再用重氮化反應(yīng)。②帶有羥基、酮基、醛基的半抗原，如醇、酚、糖、多糖、核苷以及甾族激素等，它們都不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法在半抗原上引起羧基后才能與載體連接。③芳香族半抗原由于環(huán)上帶有羧基，它鄰位上的氫很活潑，極易取代。
半抗原和載體連接的方法在一般實驗室皆可完成，但反應(yīng)條件應(yīng)嚴(yán)格要求，以防半抗原失活或載體嚴(yán)重變性（一般變性并不妨礙）。
1．碳化二亞胺法碳化二亞胺是一種化學(xué)性質(zhì)非?；顫姷碾p功能試劑，常用的水溶性碳化二亞胺化學(xué)名為1-乙基-3-（3-二甲氨基）-碳化二亞胺鹽酸鹽。它可與半抗原的羧基、也可與其氨基結(jié)合，反應(yīng)如下：+
此連接方法十分簡便，只需將載體蛋白質(zhì)和抗原按一定比例混合在適當(dāng)?shù)娜芤褐?，然后加入水溶性碳化二亞胺，攪?～2h，置室溫24h，再經(jīng)透析即可。
2．戊二醛法戊二醛也是常用的雙功能交聯(lián)劑，它借兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價鍵連接，其反應(yīng)如下：
蛋白質(zhì)-NH2+半抗原-NH2+COH-(CH2)3-COH→蛋白質(zhì)-N=CH-(CH2)3-CH=N-半抗原
3．氯甲酸異丁酯法該法又稱為混合酸酐法，是利用半抗原上的羧基和載體蛋白上的氨基以肽鏈相連接，方法簡便，多用于類固醇抗原的制備，其反應(yīng)如下：
（三）無羧基和氨基半抗原衍生物的制備
某些類固醇和藥物，需加以適當(dāng)?shù)母脑?，使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然虬被难苌铩Ｒ罁?jù)半抗原的性質(zhì)有如下4種方法。
1．琥珀酸酐法琥珀酸酐是琥珀酸的脫水產(chǎn)物，遇水又可恢復(fù)。如果將帶有羥基的半抗原化合物和琥珀酸酐在無水的吡淀中反應(yīng)，就可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。再經(jīng)碳化二亞胺可氯甲酸異丁酯法，制備載體半抗原。制備衍生物的反應(yīng)如下：
2．O-（羧甲基）羧胺法帶有酮基的半抗原與O-（羧甲基）羥反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌?。反?yīng)式如下：
半抗原-C=O+H2N-O-CH2COOH→半抗原-C=N=O=CH2-COOH
3．一氯醋鈉法帶有酚基的半抗原，可用一氯醋酸鈉法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。其反應(yīng)式如下：
4．重氮的對氨基苯甲酸法先將對氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生再作用于帶有酚基的半抗原，獲得帶有羧基的半抗原衍生物。反應(yīng)式如下：