《免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗》 二、可溶性抗原的制備和純化

蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、細(xì)菌毒素、酶、補(bǔ)體等皆為良好的可溶抗原。但因這些蛋白質(zhì)多為復(fù)雜的蛋白組分，免疫前需進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)純化方法在生物化學(xué)技術(shù)中已有詳述，本章主要介紹免疫化學(xué)純化方法。

（一）組織和細(xì)胞粗抗原的制備

免疫原多來源于只類及動物的組織或細(xì)胞，這些材料在取得可溶性蛋白質(zhì)之前，必須先進(jìn)行處理，以適合于進(jìn)一步純化。

1．組織細(xì)胞抗原的制備所用組織必須是新鮮的或低溫(＜－40℃）保存的。器官或組織得到后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織以及一些大血管。如有條件，臟器應(yīng)進(jìn)行灌注，除去血管內(nèi)殘留的血液。處理好的組織用0.05/NaN3生理鹽水洗去血跡及污染物。將洗凈的組織剪成小塊，進(jìn)行粉碎。粉碎的方法有兩類：①高速組搗碎機(jī)法。操作時，將組織加鹽水（約1/2）裝入搗碎機(jī)筒內(nèi)，用高速（約1000r/min）間斷進(jìn)行，每次30～60s，時間過長會產(chǎn)熱。②研磨法?？捎貌Ａ驖{器或乳缽研磨。玻璃勻漿器是由一內(nèi)壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為圓柱狀（表面亦經(jīng)磨砂）的磨桿組成，主要經(jīng)過旋轉(zhuǎn)、壓擠將組織粉粹。研磨法可用于韌性較大聽組織，如皮膚、空腔器官等。為了更有效地磨碎組織，有時在研磨時加入淘洗過的海砂。組織勻漿通過2000～3000r/min離心10min后分成兩個部分：沉淀物含有大量的組織細(xì)胞和碎片；上清液作為提取可溶性抗原的材料，提取前還要通過1000～2000r/min20～30min的高速離心，以除去微小的細(xì)胞碎片，此時上清液應(yīng)澄清。

2．組織細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞可溶性抗原的制備制備抗原用的細(xì)胞包括正常細(xì)胞、病理細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）或傳代細(xì)胞。組織細(xì)胞的制備一般通過上述機(jī)械破碎后取得?；蛲ㄟ^酶消化，所用的酶大多為胃蛋白酶或胰酶。通過酶解將細(xì)胞間質(zhì)蛋白消化，獲得游離的單個細(xì)胞。細(xì)胞抗原一般分為三個組分：膜蛋白抗原、細(xì)胞漿抗原（主要為細(xì)胞器）和細(xì)胞核及核膜抗原。三種抗原的制備皆需將細(xì)胞破碎，方法有如下幾種。

（1）反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞（有時為整塊組織）置－20冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后緩慢地融化。如此反復(fù)2次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆粒可被融破。

（2）冷熱交替法：在細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)及核酸時可用此法。操作時，將材料投入沸水浴中，90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。

（3）超聲破碎法：對微生物和組織細(xì)胞多用此法。處理效果與樣品濃度和使用頻率有關(guān)。一般組織細(xì)胞皆易破碎，而細(xì)菌，尤其是真菌的厚膜孢子則較難打破。超聲波所使用的頻率從1～20kHz不等。同樣要間歇進(jìn)行，因長時間超聲也會產(chǎn)熱，易導(dǎo)致抗原破壞。一次超聲1～2min，總時間為10～15min。

（4）自溶法：利用組織和微生物的自身酶系，在一定的pH和溫度下，使其細(xì)胞裂解。自溶的溫度，對動物組織細(xì)胞常選0～4℃，而對微生物常選室溫。自溶時常需加入少量防腐劑，如甲苯或氯仿等，NaN3不宜使用，因其能抑制酶的活力。

（5）溶菌酶處理法：在堿性條件下（pH8.0），溶菌酶可專一破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，適用于多種微生物。除溶菌酶外，蝸牛酶、纖維素酶等也可用于消化細(xì)菌和組織細(xì)胞。

（6）表面活性劑處理法：常用的有十二烷基吡啶、支氧膽酸鈉等。因效果較差，已少應(yīng)用。

（二）超速離心和梯度密度離心法

超速離心是分離亞細(xì)胞及蛋白質(zhì)大分子的有效手段，往往是進(jìn)一步純化的第一次過篩。超速離心又分差速離心和梯度離心。差速離心系指低速與高速離心交替進(jìn)行，用于分離大小差別較大的顆粒。梯度密度離心是一種區(qū)帶分離法，通過梯度密度來維持重力的穩(wěn)定性。通過離心，沉淀的顆粒比液體的比重大，漂浮的顆粒比液體的比重小。通常待分離的懸液中的顆粒比液體重，假如要使之上浮，必須加入第三種成分，使其密度連續(xù)或不連續(xù)地升高，形成所謂梯度。第三種成分多用甘油、蔗糖、氯化銫或氯化銣等。假如梯度柱的范圍所表現(xiàn)的密度同待分離顆粒的密度大致相等時，則經(jīng)過較長時間離心可得到分離。這種方法稱為密度離心或梯度離心。

用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據(jù)抗原的比重特點(diǎn)分離的方法，除個別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。目前僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原物質(zhì)如載脂蛋白A、B等。對于大量的中、小分子量蛋白質(zhì)，多不適宜用超速及梯度密度離心作為純化手段。

（三）選擇性沉淀法

選擇性沉淀是采用各種沉淀劑或改變某些條件促使抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。

1．核酸去除法從微生物或細(xì)胞提取蛋白質(zhì)抗原時，其中常含有大量核酸成分。除去核酸可用提取沉淀劑，如氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。核糖核酸降解法較為簡便，用DNA或RNA酶與提取液共同作用30～60min（4℃），即可有效地除去核酸成分。

2．鹽析沉淀法這是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離動技術(shù)。由于方法簡便、有效、不損害抗原活性等優(yōu)點(diǎn)，至今仍被廣泛應(yīng)用。

（1）抗原的粗篩：用不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉可將一個復(fù)雜的組織液吩成若干組分，也可收集某一飽和度的鹽析沉淀物作為進(jìn)一步純化的粗篩物。最常用的鹽析劑是33％～50％飽和度的硫酸銨。

（2）提取丙種球蛋白：丙種球蛋白主要為IgG（95％以上）。將35％～40％飽和度的硫酸銨沉淀物經(jīng)去鹽后可直接用于某些試驗作為抗體試劑。此法簡單、穩(wěn)定、固收率高，已成為免疫化學(xué)試驗的常規(guī)方法。

（3）抗原的濃縮：在液體中含量較少的抗原，如尿中的游離輕鏈及離子交換層析洗脫液中的抗原，可通過加入硫酸銨，將其沉淀下來，以利進(jìn)一步純化。

3．有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑以降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度降低。另外，有機(jī)溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中被沉淀析出。使用的有機(jī)溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度的有機(jī)溶劑易引起蛋白質(zhì)變性、失活、操作必須在低溫下進(jìn)行。Cohn（1942）低溫酒精沉淀法可將血漿蛋白分為5個組分，IgG屬于Cohn-3組分。

4．水溶性非離子型聚合物沉淀法常用的聚合物為聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)制尚不清楚，大致有如下解釋：①聚合物與蛋白質(zhì)形成共沉物；①聚合物與蛋白質(zhì)之間發(fā)生水的重分配；①聚合物與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。此法受許多因素影響，主要是pH、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度和PEG的分子量等。分子量為2000～6000的PEG皆適宜于做蛋白沉淀用。如若使用得當(dāng)，效果甚為滿意。一般認(rèn)為，PEG濃度在3％～4％時沉淀免疫復(fù)合物，6％～7％可沉淀IgM，8％～12％可沉淀IgG，12％～15％可沉淀其他球蛋白，25％可沉淀白蛋白。最突出的應(yīng)用是用3％～4％的PEG沉淀免疫復(fù)合物，未結(jié)合的抗原和抗體留在溶液中。按此原理設(shè)計了快速測定法和循環(huán)免疫復(fù)合物測定法。

（四）凝膠過濾和離子交換層析

凝膠過濾又名分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。離子交換層析是利用一些帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原，將蛋白質(zhì)抗原按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。這兩種層析如能共同應(yīng)用或者反復(fù)應(yīng)用其中的一種，皆可將某一蛋白質(zhì)從一復(fù)雜的組分中純化出來。

（五）親和層析

上面介紹的各種純方法主要是依賴抗原的物理和化學(xué)特性，如分子量、攜帶電荷等，經(jīng)過純化后只能取得相同性質(zhì)的物質(zhì)，在免疫特性上是否為同種物質(zhì)還不能肯定。親和層析是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復(fù)合物。如果將復(fù)合物的一方固定在不溶性載體上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當(dāng)高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點(diǎn)是迅速，有時僅一步即可達(dá)到純化的目的。

1．親和層析支持物的選擇作為親和層析支持物須符合以下要求：①非特異性吸附低；②液體通過時流速要快；③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；④必須有合適的、豐富的化學(xué)基團(tuán)，能有效地與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；⑤必須帶有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。符合以上5個條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。

2．配體的選擇所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下3個條件。

（1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。

（2）抗原與抗體之間必須有強(qiáng)的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質(zhì)和數(shù)量。對抗體來說還決定于抗體來源動物的種類和免疫時間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時間短的親和力低。但是，親和力太強(qiáng)也不利，因為解離抗原抗體復(fù)合物所需要的條件就要強(qiáng)烈，從而可造成蛋白質(zhì)的變性。例如用低pH（1.5～2.5）或高鹽（如6mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。

（3）配體必須有一個適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這個基團(tuán)不參與配體和大分子的特異結(jié)合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應(yīng)當(dāng)影響配體與大分子結(jié)合的親和性。

3．抗原或抗體與支持物的結(jié)合將抗原或抗體結(jié)合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結(jié)為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法4類。

結(jié)合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團(tuán)，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團(tuán)上。用來發(fā)生交聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯(lián)的物質(zhì)。

最常用的支持物是Separose4B，將此支持物與溴化氰在pH11時進(jìn)行處理，則能使支持物活化。此時溴化氰與支持物上的羥式反應(yīng)形成氨基甲酸酯基團(tuán)。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。交聯(lián)時首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯(lián)反應(yīng)混合物中的交聯(lián)蛋白質(zhì)濃度應(yīng)是親和分離濃度的20～30倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到200mg/ml凝膠。若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應(yīng)減少。交聯(lián)時的pH也應(yīng)注意，pH9.5～10時，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。降低pH，也就減少了能反應(yīng)的配體濃度，交聯(lián)量就會減少。

親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結(jié)合，產(chǎn)生了所謂的無效吸附。另外，Sepharose4B交聯(lián)時要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)。基于這兩個原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長度的“手臂”。必要時這些“手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯(lián)。常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰-N－羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應(yīng)，使用極為方便。

4．親和層析條件的選擇

（1）支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團(tuán)，為了封閉這些殘基團(tuán)，必須用無關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團(tuán)。

（2）去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。先用0.2mol/LNaHCO2（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脫2～3個柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。

（3）解脫劑有多種。常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸－HC1緩沖液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/LKC1等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液。

（六）免疫球蛋白片段的制備

免疫球蛋白具有抗原性，可用以免疫動物制備相應(yīng)的抗體，而這種抗體常用于免疫球蛋白的檢測。五類免疫球蛋白皆可用前面介紹的純化方法提取出來。如將這些免疫球蛋白分解成片段，如Fc段、Fab段、輕鏈等作為免疫原制備抗血清，則可制得分辨能力更高的特異性抗體。制備方法如下：

1．溫和條件析離亞單位亞單位之間以非共價鍵、如氫鍵、靜電引力等連接起來，這些鍵結(jié)合力較弱，可經(jīng)2種方法將其斷開制備片段。第一種方法是改變pH，一般將pH調(diào)至3～4（羧基滴定范圍）和9～10（賴氨酸－酪氨酸滴定范圍），當(dāng)?shù)陀?或高于10時，亞單位會離解。這個方法是利用強(qiáng)變性劑，如8mol/L鹽酸胍等。用此可以將亞單位分開。這個方法也用于載脂蛋白抗原的解離和膠原肽的提取。

2．二硫鍵的解離二硫鍵是連接Ig肽鏈的共價鍵，解離二硫鍵可將輕鏈與重鏈分開。解離的方法多采用氧化法和還原法。氧化法的優(yōu)點(diǎn)是切開后，肽鏈不能重新形成二硫鍵，便于肽鏈純化；缺點(diǎn)是甲硫氨酸被氧化成亞砜，色氨酸側(cè)鏈被破壞。還原法是將二硫鍵還原成巰基。但這個疏基極不穩(wěn)定，易再重新結(jié)合成二硫鍵，必須及時用碘乙酸或碘代乙酰胺進(jìn)行羧甲基化。

3．溴化氰裂解法溴化氰與蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸側(cè)鏈的硫醚基起反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯。此產(chǎn)物與水反應(yīng)，將肽鏈斷裂。

4．酶裂解法因為酶解有極好的專一性，不同的片段可用不同的酶裂解。如木瓜酶可將IgG裂解成Fc和Fab（×2）3個片段，胃蛋白酶可將IgG解成F(ab＇)2和幾個小肽段，胰蛋白酶則將其切成不規(guī)則的肽鏈。作為抗原制備常用木瓜酶切斷，取得Fc段，以制備抗鏈血清。作為抗體試劑應(yīng)用，常用胃蛋白酶切斷取得F(ab＇)2。

（七）純化抗原的鑒定

純化抗原的鑒定方法較多，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳法、結(jié)晶法、免疫電泳法、免疫雙擴(kuò)散法等。事實(shí)上，僅用一種方法還無法作純度鑒定，只有幾種方法聯(lián)合應(yīng)用才較可靠。結(jié)晶法不是純度的標(biāo)準(zhǔn)，因結(jié)晶中往往含有其它成分。電泳譜中呈現(xiàn)單一區(qū)帶也不能排除在這條帶中含有其他成分。有時雖出現(xiàn)幾條帶，也可能是同一物質(zhì)的聚合體或降解物。

蛋白抗原的定量可用生化分析中的常用方法。根據(jù)測試抗原量的多少可用雙縮脲法或酚試劑法。如果抗原極為寶貴，可用紫外光吸收法。