⑵導(dǎo)數(shù)法在此法中使用電子線路計(jì)算出反應(yīng)瞬間的一階和二階導(dǎo)數(shù)：bekman system TR就使用了這樣方法，它可以同時(shí)計(jì)算出一階和二階導(dǎo)數(shù)，用二階導(dǎo)數(shù)來觀察哪一段反應(yīng)為線性反應(yīng)，并用線性反應(yīng)段上的一階導(dǎo)數(shù)計(jì)算出物質(zhì)濃度。此法單用導(dǎo)數(shù)方法并不記錄吸光度變化（△A），所以此法所提供的信息往往少于回歸法，例如無法觀察到反應(yīng)中底物的消耗情況。
臨床生化常用方法根據(jù)其測定的原理可作如圖19-5法分類。一類方法是物理方法，測定是物質(zhì)固有的物理特性。另一類是物理化學(xué)方法，也就是將所測定物質(zhì)進(jìn)行一些化學(xué)轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行測定。動(dòng)態(tài)法是在所測定的物質(zhì)濃度在不斷變化中，由傳感器獲得相應(yīng)的改變的信號(hào)進(jìn)行計(jì)算的方法。平衡法是由傳感器得到相對不變的信號(hào)進(jìn)行計(jì)算的方法。現(xiàn)在越來越多被臨床生化應(yīng)用的酶試劑方法，無論是用自動(dòng)分析儀記錄或分光亮度計(jì)或普通比色計(jì)都包括在動(dòng)態(tài)法的范圍內(nèi)。
（一）平衡法（終點(diǎn)法）
這類方法的特點(diǎn)是被測物質(zhì)（酶反應(yīng)的底物）在酶反應(yīng)過程中應(yīng)完全被轉(zhuǎn)化或消耗掉，即達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。通常這類方法操作簡單，一般不需要作標(biāo)準(zhǔn)管，通過一些已知的理化常數(shù)，例如克分子吸光系數(shù)等不難將結(jié)果計(jì)算出來。其缺點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間較長，特別不適合于離心式自動(dòng)分析儀。還有少數(shù)酶反應(yīng)，底物并未完全消耗掉，只是達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)，往往需要同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)管。
圖19-5 臨床生化方法的分類
⒈一步法 試劑酶的底物（S）就是所測的物質(zhì)，在試劑酶作用于S后完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物（P），由于S和P具有完全不同的理化性質(zhì)，從而可根據(jù)對S或P的濃度變化進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。使用最多的還是光度法，尤其是在340nm處測定NAD(P)H的生成或消耗量。在實(shí)際應(yīng)用上最多的仍是和NAD(P)H有關(guān)的脫氫反應(yīng)。如用乙醇脫氫酶測乙醇的含量或用乳酸脫氫酶測丙酮酸等。
⒉酶偶聯(lián)反應(yīng)和測定酶活性方法一樣，有時(shí)單用一個(gè)酶（輔助酶，Ea）不行，因?yàn)镾和P之間往往無明顯差異，不能直接測定，此時(shí)可以加入另外的酶（指示酶，Ei），將反應(yīng)偶聯(lián)起來，通過測定指示酶反應(yīng)間接推算出所測物質(zhì)，即第一個(gè)酶作用底物的濃度。
反應(yīng)通式如下：
若Ei是一個(gè)脫氫酶，在反應(yīng)過程中同時(shí)伴有NAD(P)H和NAD(P)間的轉(zhuǎn)化，故不難在340nm處進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。另一常用的酶是過氧化物酶，可以通過新生態(tài)氧和一些色素原作用顯色而進(jìn)行測定。例如用已糖激酶（HK）法和葡萄糖氧化酶（GOD）法來測定葡萄糖等。
另外，還有一類少用的偶聯(lián)酶反應(yīng)，指示酶反應(yīng)在輔助酶反應(yīng)之前，而不是在后。
式中S1是欲測物質(zhì)，往往另一底物S2不穩(wěn)定，通過先行的指示酶產(chǎn)生S2，如乙酰CoA的測定。
其中草酰乙酸很不穩(wěn)定，可通過蘋果酸脫氫酶作用生成。
從理論上說酶催化反應(yīng)都是可逆的反應(yīng)，除水解酶外，大多數(shù)酶往往都不易將底物完全轉(zhuǎn)換或消耗掉。?？赏ㄟ^增加不需測定的另一底物濃度，改變pH，使用捕獲劑（trap-ping agent）等改變平衡點(diǎn)，使反應(yīng)偏向一側(cè)，達(dá)到或接近反應(yīng)完全。
（二）動(dòng)態(tài)法
動(dòng)態(tài)法在自動(dòng)分析儀中的應(yīng)用十分廣泛，但是動(dòng)態(tài)法的分類一直比較混亂。一般可分為可變信號(hào)法和固定信號(hào)法兩類。
⒈可變信號(hào)法
⑴直接法即根據(jù)所得到的吸光度變化直接計(jì)算結(jié)果：由于對所收集數(shù)據(jù)多少有很大意義，所以又區(qū)分為一點(diǎn)法、二點(diǎn)法、多點(diǎn)法。一點(diǎn)法是在一個(gè)預(yù)先設(shè)置時(shí)間測定各個(gè)標(biāo)本吸光度。二點(diǎn)法則是在一點(diǎn)法基礎(chǔ)上多測一點(diǎn)，即在酶反應(yīng)仍未進(jìn)行時(shí)的吸光度，和一點(diǎn)法相比可以通過空白測定扣除這部分誤差，但是仍無法了解反應(yīng)過程，避免不了延緩期或非線性反應(yīng)所引起的誤差。多點(diǎn)法如使用確當(dāng)，對標(biāo)本空白和反應(yīng)過程都有詳細(xì)了解，可用以下兩法：
一法是求出不同測定點(diǎn)間吸光度的差異即所謂delta法。各點(diǎn)吸光度差異可用б＝△A＝An－An－1計(jì)算出。根據(jù)這些數(shù)據(jù)可以觀察反應(yīng)是否符合線性，并計(jì)算出被測物質(zhì)濃度。偏離線性的數(shù)據(jù)在計(jì)算結(jié)果時(shí)應(yīng)摒棄。很多早期自動(dòng)生化儀都使用此法。另一法則是使用回歸法，根據(jù)一定公式如線性公式y(tǒng)＝a＋bx對獲得的多個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，求出斜率b和截距a。這類方法也可用于濃度計(jì)算。和delta方法相比，不僅可適用于線性反應(yīng)，也可適用于其它非線性反應(yīng)。
⑵導(dǎo)數(shù)法在此法中使用電子線路計(jì)算出反應(yīng)瞬間的一階和二階導(dǎo)數(shù)：bekman system TR就使用了這樣方法，它可以同時(shí)計(jì)算出一階和二階導(dǎo)數(shù)，用二階導(dǎo)數(shù)來觀察哪一段反應(yīng)為線性反應(yīng)，并用線性反應(yīng)段上的一階導(dǎo)數(shù)計(jì)算出物質(zhì)濃度。此法單用導(dǎo)數(shù)方法并不記錄吸光度變化（△A），所以此法所提供的信息往往少于回歸法，例如無法觀察到反應(yīng)中底物的消耗情況。
⑶積分法此法原理是運(yùn)算放大器對反應(yīng)曲線二個(gè)節(jié)段的吸光度進(jìn)行積分。并計(jì)算出部分面積之差。Vitatron分析儀用此差值來考慮線性段，但仍用△A法計(jì)算結(jié)果。
⒉固定信號(hào)法測定原理是隨著反應(yīng)進(jìn)行，通過不斷添加試劑使吸光度變化在很窄范圍內(nèi)，此時(shí)所測的是加試劑的量，并依此來計(jì)算物質(zhì)濃度。最典型例子是以對硝基酚作為指示劑的乙酰膽堿酯酶方法，在反應(yīng)過程中不斷加入堿以中和酶水解產(chǎn)物乙酸以維持pH不變，然后根據(jù)所加堿量計(jì)算酶含量。這一類方法由于操作費(fèi)時(shí)麻煩，目前應(yīng)用很少，但不應(yīng)忘記這類方法能維持反應(yīng)條件如pH的恒定性，其它如在NADH參與的反應(yīng)中不斷加入NADH有助于避免底物的消耗，在一些特殊情況下可能還是有用的。
由此可見，假如從方便簡單不需復(fù)雜儀器而言，則一點(diǎn)和二點(diǎn)法應(yīng)為首選。而回歸法、積分和導(dǎo)數(shù)法不易進(jìn)行。如從可靠性來進(jìn)行比較，則多點(diǎn)回歸法應(yīng)居榜首，一點(diǎn)和二點(diǎn)法最不準(zhǔn)確。
回歸法的缺點(diǎn)是此法可以不考慮收集的數(shù)據(jù)是否可靠，不管各數(shù)據(jù)是否偏離曲線或明顯不呈線性，也可求得一個(gè)線性方程式。所以，一個(gè)好的回歸方程式還應(yīng)給出標(biāo)準(zhǔn)差和有關(guān)參數(shù)，這樣即可用來評(píng)價(jià)用回歸法所得結(jié)果的可靠性。根據(jù)Pardue意見，使用較多數(shù)據(jù)且設(shè)計(jì)良好的回歸方法是首選的。
（三）固定時(shí)間法（二點(diǎn)法）
固定時(shí)間法在自動(dòng)分析儀中的應(yīng)用，有助于我們解決反應(yīng)的特異性問題，最明顯的例子就是苦味酸法測肌酐和溴甲酚綠法測白蛋白。人們早就知道很多物質(zhì)如維生素C、乙酰醋酸、葡萄糖、果糖以及某些藥物也能和苦味酸呈色。近年來發(fā)現(xiàn)這些干擾物質(zhì)呈色較慢，提出用自動(dòng)生化儀只測定開始一分鐘的反應(yīng)，明顯提高了苦味酸法測肌酐的特異性。用溴甲酚綠測白蛋白法，此法由于簡單易行，在70年代取代了經(jīng)典的鹽析法，但隨即發(fā)現(xiàn)一部分球蛋白如α球蛋白也能和溴甲酚綠結(jié)合，但這類反應(yīng)比較遲，所以目前更多地使用自動(dòng)分析儀測定開始一分鐘的反應(yīng)來計(jì)算白蛋白量。
固定時(shí)間法之所以受到愈來愈多注意，更重要因素是酶試劑的應(yīng)用（詳見有關(guān)章節(jié)）。
（四）空白對照方法
由于使用了各種高新技術(shù)，在自動(dòng)生化分析儀中人們可以根據(jù)實(shí)際情況，使用各種空白和對照方法。
⒈固定法空白①試劑；②標(biāo)本＋鹽水；③標(biāo)本＋空白試劑；④標(biāo)本＋滅能試劑；⑤標(biāo)本＋完全試劑（時(shí)間不同）；
⒉動(dòng)態(tài)法空白①試劑空白；②標(biāo)本＋空白試劑。
從理論上說固定空白法用“標(biāo)本＋完全試劑”是最好的辦法，此法可以扣除各種因素的誤差，如試劑、比色杯等，這也是在自動(dòng)生化儀應(yīng)用較多的方法，而用手工法是不易做到的。動(dòng)態(tài)空白僅用于少數(shù)試劑不穩(wěn)定方法，如以固紅B測天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。