《基因診斷與性傳播疾病》 三、核酸分子雜交方法

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，新的核酸分子雜交技術(shù)不斷出現(xiàn)和完善，核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。

在固相雜交中，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點，所以比較常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。

液相雜交是一種研究最早且操作簡便的雜交類型，由于液相雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高，所以不如固相雜交那樣普遍。近幾年由于雜交檢測技術(shù)的不斷改進，商業(yè)性基因探針診斷盒的實際應(yīng)用，推動了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展，下面對固相雜交和液相雜交分別進行介紹。

（一）固相膜核酸分子雜交方法。

固相核酸雜交多是在膜上進行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法。

1．DNA的變性解鏈是雜交成功的關(guān)鍵,Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性,變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時，然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強酸會使核酸降解。堿變性可避免DNA的降解、熱變性要在低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml，加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10mol/l HC1或5mol/L NaH2PO4調(diào)pH到7-8(亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100℃后，調(diào)至中性，或只加熱100℃10min)。DNA變性可用OD260增加（約30-40%）來檢測，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰溶保存。

2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定。硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45um）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min～2h，涼干，DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。

3．預(yù)雜交。濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，用封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68℃水浴中保溫3-12h，當預(yù)雜交液溫度升至68℃時，在濾膜表面常會形成水氣泡，輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預(yù)雜交液很重要。

4．雜交?！乃≈腥〕鏊芰洗眉舻都糸_一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液，用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好足量的液體保持濾膜濕潤（50ul/cm2）。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/L　EDTA，變性的標記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴密封口。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進行，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般為4-20h。

5．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中,室溫下漂洗5min,再將濾膜移入2×SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動),然后將濾膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。

洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3+0.41×(G+C）%]，雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數(shù)每增加1%而遞減1℃。

6．結(jié)果顯示。放射性測定方法，固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射自顯影法、另一是液閃計數(shù)法，放射自顯影法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時至數(shù)天，再顯影，定影即可。對于雜交信號較強的固相膜，用一塊增敏屏可顯著增強暴光強度。此外，為了減弱32P的放射，暴光通常在-20℃或-80℃下進行。液閃計數(shù)法主要用于斑點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強弱等情形，方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊），80℃真空干燥后裝閃爍瓶，加入2—5ml閃爍液，剪2-3塊無樣品作為本底對照，在液體閃爍計數(shù)器上自動計數(shù)，液體計數(shù)測定放射性強度也可以在放射自顯影之后進行。

（二）固相核酸分子雜交類型

1．菌落原位雜交（colony in　situhybridization）。是將細菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA，將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號、并與主平板上的菌落對位。

實驗步驟如下：

①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。

②培養(yǎng)細菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。

③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體，將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙上，菌落面在上，注意防止濾膜底面存有氣泡。

④5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。

⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L Tris-HClpH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min，重復(fù)中和一次。

⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min，SSPE配成20×貯備液：3.6mol/lNaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。

⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。

2．斑點雜交（Dot blot）。是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。

（1）DNA斑點雜交：

①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

③用鉛筆在濾膜上標好位置,將DNA點樣于膜上,每個樣品一般點5μl(2~10μg DNA)。

④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）RNA斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。

（3）完整細胞斑點雜交：應(yīng)用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養(yǎng)物的特異序列進行快速檢測，將整個細胞點到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交，但它不適用于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產(chǎn)生高本底。

3.Southern印跡雜交（Southern blot）。是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交的基本方法是將DNA標本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和和高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上、烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著，附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確立探針互補的每一條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多消化產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（1）瓊脂糖凝膠電泳。利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消解片段（0.3～25kb）分離開，分離大分子DNA片段（800-12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%），分離小分子片段（500～1000bp）用高濃度瓊脂糖（1.0%），300-5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠。根據(jù)分離樣品品質(zhì)，分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。

電泳時，同時將分子量標記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過夜，電泳完畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在灌膠前加入膠片中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5，曝光20-40s。

（2）硝酸纖維素膜吸印。

[1]將膠片切成合適大小，切去右上角作為記號。

[2]將膠片放進盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl,0.5mol/L NaOH）的盤中輕晃15min。

[3]換到中和緩沖液（1mol/l Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盤中輕晃30min。

[4]裁一張硝酸纖維素膜、2-4張3mm濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙），都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路）。先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC緩沖液,接觸膠和硝酸纖維素膜時都要戴手套操作。

[5]平盤上放一塊比膠大的平板上面鋪一張3mm濾紙,起燈蕊作用,盤中加入少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚），不能沒過平板，使3mm濾紙充分飽和。

[6]將膠倒扣在3mm濾紙上。

[7]浸濕的硝酸纖維素膜在膠上，對齊。鋪膜時從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。

[8]膜上放一張3mm濾紙，不能與膠接觸。

[9]上面加吸印紙及重物（500g左右）。

[10]通過濾紙的燈芯作用，平盤中的緩沖液就會通過膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時更換浸濕的吸印紙，在室溫下轉(zhuǎn)印過夜。

[11]清除上面的東西。用鑷子將膜取出，在6×SSC中洗一下。

[12]自然干燥，80℃烤2h。

[13]這是的膜就可進行雜交，或室溫密封保存。

4．Northern印跡雜交（Northernblot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。Northern　印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2'-羥基基團。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后用低鹽緩沖液洗脫，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因為它會影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合。為測定片段大小，可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳，之后將標記物切下、上色、照像，樣品膠則進行Northern轉(zhuǎn)印。標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸銨中10min，光在水中就可脫色，在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或在白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化銀是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。

RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法。

試劑：

10×MSE緩沖液：0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸鈉，1mmol/L　EDTA　pH8.0。

5×載樣緩沖液：50%甘油，1mmol/lEDTA，0.4%溴酚藍。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L），應(yīng)在通風柜中操作，pH高于4.0。

20×SSC；

去離子甲酰胺；

50mmol/LNaOH(含10mmol/L NaCl)；

0.1mol/LTris，pH7.5。

步驟：

[1]40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml10×MSE緩沖液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混勻后倒入盛膠槽。

[2]等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。

[3]使RNA變性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE緩沖液20ml，甲醛3.5ml，去離子甲酰胺10ml。

[4]55℃加熱15min，冰浴冷卻。

[5]加2ml5×載樣緩沖液。

[6]上樣、同時加RNA標記物。

[7]60伏電泳過夜。

[8]取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

[9]室溫下將膠浸到50mmol/l NaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增強轉(zhuǎn)印。

[10]室溫下將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。

[11]20×SSC洗膠1h。

[12]20×SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。

[13]取出硝酸纖維素膜，80℃真空烘烤2h。

5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）。組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交，而原位雜交是經(jīng)適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置，對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。

用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針操作的長度以100-400nt為宜，過長則雜交率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16-30nt）能自由出入細菌和組織細胞壁，雜交效率明顯高于長探針，因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。

探針的標記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最為常用，3H標記的探針半衰期長，成像分辨率高，便于定位，缺點是能量低，35S標記探針活性較高，影像分辨率也較好，而32P能量過高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點。

原位雜交中，標本的固定條件是影響雜交效率的重要因素。標本組織蛋白質(zhì)的消化程度對探針進入細胞極為重要，去除蛋白質(zhì)的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水。原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性、穩(wěn)定性上還需進一步完善和提高。

6，固相夾心雜交。Dunn等最早介紹了夾心雜交類型，Ranki等又作了進一步的改進，夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優(yōu)點：（1）樣品不需固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；（2）用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測的信號。

固相夾心法雜交需要兩個靠近而又互相重疊的探針，一個做固相吸附探針，另一個作標記檢測探針，樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)，需要注意的是兩探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號。

夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進行標準化試驗和更容易對小量樣品進行操作。Dahlen等利用微孔板進行夾心雜交，可同時進行大量樣品檢測，他們先吸附DNA探針加到凹板中，然后用紫外線照射使其固定到塑料板上，用微孔板進行夾心雜交還可直接用于PCR技術(shù)。應(yīng)用光敏生物素標記探針，檢測PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標記探針（3×108cpm/μg）作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點還有可同時操作多份樣品，加樣、漂洗和讀結(jié)果等步驟可以自動化。

7． 其它雜交類型

（1）固化探針雜交。該法較少使用，原理是使未標記固化探針通過雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合，將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗、加入底物顯色并進行測定，探針濃度為2μg/ml,80℃雜交，可在10-15min完成，檢測的敏感性為5×106靶序列。

（2）反向雜交：這個雜交類型是用標記的樣品核酸與未標記的固化探針DNA雜交，故稱為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點是在一次雜交中，可同時檢測樣品中幾種核酸。這種雜交方式主要用于進行中的核轉(zhuǎn)錄試驗和多種病原微生物的檢測，前者是在轉(zhuǎn)錄過程中標記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標記樣品核酸。

8．固相膜核酸雜交膜的選用。雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進行檢測。最常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射性標記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結(jié)合的化學(xué)性不是很清楚，推測為非共價鍵結(jié)合，經(jīng)80℃烤干2h和雜交處理后，核酸仍不會脫落。硝酸纖維素膜的另一特點是只與蛋白有微弱非特異結(jié)合，這在使用同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽（>10×SSC）,與小片核酸(