《基因診斷與性傳播疾病》 第二節(jié)　核酸分子雜交法

這是最早用于性病診斷的重組DNA技術(shù)?；驹硎蔷哂幸欢ㄍ葱缘膬蓷l核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。待測核酸序列為性病病原體基因組或質(zhì)粒DNA。探針以放射核素或非放射性核素標(biāo)記，以利于雜交信號(hào)的檢測。

所謂雜交（hydridization）指兩個(gè)以上的分子因具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體（hybrid），雜交體中的分子不是來自一個(gè)二聚體分子。同一個(gè)二聚體中的兩個(gè)分子在變性解離后重組合稱為復(fù)性。利用兩條不同來源的多核苷酸鏈之間的互補(bǔ)性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核酸雜交技術(shù)相對應(yīng)的另一項(xiàng)技術(shù)被稱為探針技術(shù)，它是指利用標(biāo)記分子對其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對后者進(jìn)行檢測的一種技術(shù)，我們把標(biāo)記的分子叫探針（Probe）。將探針技術(shù)與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，從而使分子雜交技術(shù)得以廣泛推廣應(yīng)用。目前所用的核酸雜交技術(shù)均應(yīng)用了標(biāo)記技術(shù)。

（一）DNA的變性

DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團(tuán)，稱為DNA變性。加熱、改變DNA溶液中的pH，或有機(jī)溶劑等理化因素的影響，均可使DNA變性。變性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。

（二）DNA復(fù)性

變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。

核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對之間非共價(jià)健的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間，由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時(shí)，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實(shí)現(xiàn)。使單鏈聚合成雙鏈過程稱為退火或復(fù)性。用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交。

（三）探針——靶分子反應(yīng)

從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)?？贵w——抗體、外源凝集素——碳水化合物、親合素——生物素、受體——配基（Ligand）以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針——靶分子反應(yīng)，蛋白質(zhì)探針（如抗體）與特異靶分子是通過混合力（疏水離子和氫鍵）的作用在少數(shù)特異位點(diǎn)上的結(jié)合，而核酸探針與互補(bǔ)鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長短不同，通過氫鍵幾十、幾百甚至上千個(gè)位點(diǎn)上的結(jié)合。這就決定它的特異性。

基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類。DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。