《基因診斷與性傳播疾病》 一、核酸探針的種類

（一）DNA探針

DNA探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲的DNA探針?lè)N類很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比用G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向，加之分子雜交技術(shù)的高度敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。

DNA探針（包括cDNA探針）有三大優(yōu)點(diǎn)：第一，這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。其次，DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機(jī)引物法、PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。

（二）cDNA探針

cDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子（complementary DNA）。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，并進(jìn)而整合入宿主細(xì)胞染色體DNA分子，隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制同時(shí)復(fù)制，這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達(dá)，故無(wú)毒性，一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制。如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達(dá)。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶也已商品化。最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補(bǔ)于mRNA的cDNA鏈，然后再用RNaseH將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個(gè)有限制酶切點(diǎn)的接頭(Adapter),再經(jīng)特定限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補(bǔ)末端的載體進(jìn)行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。用這類載體可以得到包含105以上轉(zhuǎn)化子文庫(kù)，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測(cè)。

（三）RNA探針

RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過(guò)程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測(cè)。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA克隆時(shí)，因無(wú)DNA探針可利用，獲得HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。

隨著體外逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已成功的建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體PSP和PGEM，這類載體在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別帶有SP6啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄。如果在多克隆位點(diǎn)接頭中插入了外源DNA片段，則可以以DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1小時(shí)內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)物。只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的dUTP，則所合成的RNA可得高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長(zhǎng)度并可提高標(biāo)記分子的利用率。

RNA探針和cDNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。

（四）寡核苷酸探針

前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測(cè)序時(shí)，也常應(yīng)用克隆探針?？寺√结樢话爿^寡核苷酸探針的特異性強(qiáng)，復(fù)雜度也高，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言，較長(zhǎng)的序列隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會(huì)較短序列少?？寺√结樀牧硪粌?yōu)點(diǎn)是，可獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)，因?yàn)榭寺√结樰^寡核苷酸探針摻入的可檢測(cè)標(biāo)記基因更多。但是，較長(zhǎng)的探針對(duì)于靶序列變異的識(shí)別能力又有所降低。對(duì)于僅是單個(gè)堿基或少數(shù)堿基不配的兩個(gè)序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號(hào)相當(dāng)。這既是其優(yōu)點(diǎn)，又是其缺點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)用于檢測(cè)病原微生物時(shí)，不會(huì)因病毒或細(xì)菌DNA的少許變異而漏診，缺點(diǎn)則是不能用于檢測(cè)突變點(diǎn)。這種情況，通常要采用化學(xué)合成的寡核苷酸探針。

合成的寡核苷酸探針具有以下特點(diǎn)：第一，由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短。第二，寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)一個(gè)堿基的變化，因?yàn)槎烫结樦袎A基錯(cuò)配能大幅度降低雜交體的Tm值。第三，一次可大量合成寡核苷酸探針，使得這種探針價(jià)格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。最常用的寡核苷酸探針長(zhǎng)18—40個(gè)鹼基，目前的合成可有效地合成至少50個(gè)堿基的探針。

對(duì)于合成的寡核苷酸探針有以下要求：

（1）長(zhǎng)度以18-50堿基為宜，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)，合成量也低；較短探針特異性較差。

（2）堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會(huì)增加非特異雜交。

（3）探針?lè)肿觾?nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。

（4）避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)。

（5）一旦選定某一序列符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將該序列與核酸庫(kù)中的核酸序列比較，探針序列應(yīng)與靶序列核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不應(yīng)超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源。否則，該探針不能用。