《動(dòng)脈粥樣硬化》 二、SDS-PAGE結(jié)合免疫印跡法檢測(cè)Apo（a）表型

檢測(cè)Apo（a）表型的方法中，以Utermann法或其改良法最為常用。這類(lèi)方法先用SDS-PAGE分離Apo（a）異構(gòu)體，然后用特異的多克隆或單克隆抗體作免疫印跡顯示。

1．儀器與試劑

電泳儀，夾心式垂直板電泳槽及凝膠轉(zhuǎn)移電泳槽，NC膜（孔徑0.45μm,轉(zhuǎn)移電泳用）；高分子量系列蛋白標(biāo)準(zhǔn)（MW67000～669000，Pharmacia產(chǎn)品）；ApoB100純品；主要試劑有：①30%丙烯酰胺貯存液；②電泳緩沖液為pH8.3，內(nèi)含0.1%SDS的0.025mol/lTris-0.192mol/L甘氨酸溶液；③轉(zhuǎn)移電泳緩沖液為pH8.3，內(nèi)含20%甲醇的0.02mol/lTris～0.15mol/L甘氨酸溶液；④樣品處理緩沖液：50g/l SDS水溶液4ml，β-疏基乙醇800μl，750ml/L甘油溶液800μl，10g/L溴酚藍(lán)溶液200μl混合；⑤洗滌緩沖液為pH7.4內(nèi)含9g/L的0.01mol/lTris-HCl溶液；⑥封閉液為內(nèi)含50g/L去脂奶粉（或含10g/L小牛血清白蛋白）的洗滌緩沖液；⑦第一抗體為羊抗人Apo（a）血清；⑧第二抗體作為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG；⑨底物溶液為脂溶性4-氯-1-萘酚底物液或水溶性二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物液。

2．實(shí)驗(yàn)方法

①凝膠板制備：按照說(shuō)明書(shū)安裝好垂直板電泳槽，參照Utermann等方法配制6.6%聚丙烯酰胺分離膠和3.6%濃縮膠制備膠板；②電泳：血清樣品18μl與100μl新鮮配制樣品處理緩沖液混勻，置100℃水浴10min，冷卻，取此混合物20μl加入樣品槽中并覆以電泳緩沖液，ApoB100與高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)處理，除不加β-巰基乙醇其他操作同前。在上下槽注入電泳緩沖液，接通電源（上槽按負(fù)極，下槽接正極）待溴酚藍(lán)跑出凝膠下沿2h即可結(jié)束電泳（通常120V電泳6h）；③轉(zhuǎn)移電泳：取此凝膠，切下分子量蛋白帶放入SDS洗脫液中過(guò)夜，以固定凝膠大小并洗脫掉未與蛋白結(jié)合的SDS，0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250染色室溫1h，7%乙酸脫去背景顏色。剩余凝膠鋪在已浸過(guò)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液的NC膜上，在凝膠NC膜外再覆以3mm厚的濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移電泳緩沖浸濕），將此濾紙/凝膠/NC膜/濾紙一同放在電泳轉(zhuǎn)移支架上，按層次相夾置于裝滿(mǎn)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液的電泳槽中，接通電源（凝膠面對(duì)負(fù)構(gòu)，NC膜面對(duì)正極）。120V電泳6h（30℃以下）或4℃30V轉(zhuǎn)移過(guò)夜；④免疫印跡分析：取出轉(zhuǎn)移后的NC膜在洗滌液中洗3次后，置封閉液中室溫封閉3h（或37℃1h），在洗滌液中洗3次，加入1：100稀釋的第一抗體并充分混勻，37℃溫浴6h（或過(guò)夜），隨后用洗滌液洗5次（10min×5）甩干。加入1：500稀釋的第二抗體，混勻，37℃作用2h，洗滌同上。加入新配制的底物溶液于室溫下?lián)u動(dòng)直至出現(xiàn)紫色（或紫褐色）并看到背景（1～5min）時(shí)用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，空氣干燥封于塑料袋中避光保存；⑤Apo（a）表型判定：量出Apo（a）蛋白帶中心距分離膠界面的距離，對(duì)照ApoB100和高分子量標(biāo)準(zhǔn)的泳動(dòng)距離，確定Apo（a）帶型及各表型的分子量范圍。在SDS-PAGE中蛋白質(zhì)的遷移速度主要取決于它的分子量大小而與其形態(tài)及所帶電荷多少無(wú)關(guān)。用巰基乙醇打開(kāi)Apo（a）與ApoB100之間的二硫鍵，Apo（a）的分子量即可通過(guò)與蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較相對(duì)遷移率的辦法而求得。并按其與ApoB100在凝膠中遷移速率的快慢而將其分為F（較ApoB100快），B（與ApoB100相似），S1、S2、S3、S4（依次較ApoB100慢）6種多態(tài)異構(gòu)體并組合成各種Apo（a）表型，見(jiàn)圖19-1所示。

圖19-1 幾種Apo（a）表型的免疫印跡分析示意圖譜

3．實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

在此方法中，聚丙烯酰胺凝膠起著載體和分子篩的雙重作用，不同濃度的凝膠適于不同分子量的蛋白質(zhì)分離，國(guó)外用于Apo（a）表型測(cè)定的凝膠濃度差異較大（3.25%～7.5%）,經(jīng)過(guò)對(duì)此實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離膠選用6.6%較為適宜，其操作方便，分離效果也較好。分離和轉(zhuǎn)移電泳都會(huì)因產(chǎn)熱而影響實(shí)驗(yàn)效果。而國(guó)產(chǎn)電泳槽冷卻裝置效果較差。為解決這一矛盾，除選用諸如Bio-Rad產(chǎn)垂直板電泳槽及轉(zhuǎn)印槽（Model 220 dualvertical-slab gel electrophoresis cell,TransblotTm cell；Bio-Rad Labs；Richmond,CA）外，可采取降低電壓延長(zhǎng)電泳時(shí)間和4℃環(huán)境中電泳的措施，也可取得較好效果，免疫印跡反應(yīng)中也可選用鼠抗人Apo（a）單克隆抗體作為一抗，用酶標(biāo)兔抗鼠IgG作為二抗。應(yīng)用酶標(biāo)抗體反應(yīng)作為二抗時(shí)，底物以脂溶性4-氯-1-萘酚或聯(lián)茴香胺較水溶性DAB溶液為好，也可用金標(biāo)、I125標(biāo)抗體作為二抗，通過(guò)銀染或放射自顯影技術(shù)顯示Apo（a）蛋白區(qū)帶，但此類(lèi)方法已較少使用。將生物素標(biāo)記的抗體作為二抗，通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)放大信號(hào)，可大大提高檢測(cè)敏感性。血清標(biāo)記貯于4℃一周或貯存于-80℃一年內(nèi)仍可檢出Apo（a）遺傳表型。Kamboh等介紹的方法多采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量定型法確定Apo（a）異構(gòu)體。Sandholzer等報(bào)道，Apo（a）6種異構(gòu)體分子量分別為F：＜400000，S1≈520000，S2≈580000，S3≈640000，S4＞700000，國(guó)外現(xiàn)已有Apo（a）表型測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物（含異構(gòu)體F、S1～S3-ImmunoAG、Austria），可用于Apo（a）異構(gòu)體判定及質(zhì)控。分子量標(biāo)準(zhǔn)除采用凝膠染色外，也可將分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白轉(zhuǎn)移電泳至NC膜上，切下非特異性轉(zhuǎn)移帶（即標(biāo)準(zhǔn)部分）用低濃度CBBG-250或氨基黑10B染色法染色，并記下標(biāo)準(zhǔn)的位置。