《動脈粥樣硬化》 一、載脂蛋白測定方法

1．單向免疫擴(kuò)散法（radialimmunodiffusion,RID）

該法較簡單，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。消耗較多的抗血清，擴(kuò)散過程至少24h，最多需72h，測定下限值為10μg/ml。該方法雖然簡單，應(yīng)嚴(yán)格控制有關(guān)條件如：含抗血清的瓊脂糖凝膠厚度要均勻；加入小孔的稀釋抗原（血清）量要準(zhǔn)確；含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL顆粒大小不一，如瓊脂糖凝膠濃度在1.5%～2.0%,可能僅測出LDL的ApoB，大顆粒的LDL及VLDL的ApoB可能無法測出，因?yàn)殡y以穿過瓊脂糖凝膠的孔隙。另外，擴(kuò)散過程中，凝膠板一定要水平，否則易使擴(kuò)散環(huán)呈橢圓形，難以準(zhǔn)確測量直徑。一般使沉淀環(huán)以3.5～10.0mm為宜，應(yīng)在兩個方向測量直徑，其精度要求達(dá)到0.1mm。采用五種不同濃度參考值，測定沉淀環(huán)面積對相應(yīng)濃度關(guān)系以曲線回歸方程作圖。

2．電免疫測定法（electroimmunoassay,EIA）

該法靈敏，抗血清用量少，如瓊脂糖緩沖液中加入聚乙二醇及甘氨酸，其電泳時間可縮短一倍，火箭峰高以1～4cm為宜，火箭峰的測量可以計(jì)算面積或峰高，峰高從中心量起。測量精度最好能在0.1mm,靈敏度約2μg/ml，又稱為火箭電泳法。

3．免疫比濁法(immunoturbidimetryassay,ITA）

簡便快速，在自動分析儀進(jìn)行操作并能批量檢測，是目前臨床使用最多的方法學(xué)。免疫比濁法有兩種：一是測定光散射的，又名免疫散射比濁法（INA）；需用特殊的激光濁度儀；另一種是利用光度計(jì)測定通過混濁溶液后的透光強(qiáng)度，稱為透射免疫比濁法（ITA），其靈敏度低于INA。比濁法可以終點(diǎn)法和速率法測定，速率法是根據(jù)散射光強(qiáng)度與時間的關(guān)系，以微機(jī)處理計(jì)算出抗原抗體復(fù)合物形成的最大反應(yīng)速度，后者與溶液中抗原量成正比，?？稍?min內(nèi)完成測定過程，可自動扣除空白；終點(diǎn)法比速率法穩(wěn)定，一般多用終點(diǎn)法。

4．酶聯(lián)免疫法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）

該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于極微量蛋白的定量測定，可測出ng級水平的抗原或抗體含量，該法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量較少的載脂蛋白的定量測定。

5．放射免疫法（radioimmunoassay,RIA）

該法靈敏，抗血清用量少，所需設(shè)備較多，一般用125I標(biāo)記抗原作為示蹤物，除ApoC-Ⅰ（不含酪氨酸）以外，都可以作碘標(biāo)記（氯胺T法），以雙抗體法測定RIA法可檢測最低至3～5ng。臨床檢驗(yàn)中不常用此法，主要用于動物實(shí)驗(yàn)的科學(xué)研究工作。

還有熒光免疫法和化學(xué)發(fā)光法等靈敏度很高的方法。

血清載脂蛋白測定的方法，從測定原理、方法學(xué)評價及參考值，劉秉文和李健齋等人作了大量的工作，為國內(nèi)的載脂蛋白測定的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。周新曾于1986年首先在國內(nèi)研制成功抗人ApoB100血清，其后，國內(nèi)同仁陸續(xù)研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清，并廣泛應(yīng)用于臨床的疾病診斷，在部分大醫(yī)院已成為常規(guī)檢查項(xiàng)目。

劉秉文在“脂蛋白與動脈粥樣硬化“一書中全面總結(jié)了國內(nèi)外載脂蛋白測定的方法學(xué)及其參考值，本節(jié)將引用如下比較表：

表18-1　ApoAⅠ免疫測定法的比較

RIAELISAEIARIDINAITA抗體P，MP，MPP，MPP靈敏度（n）0.3～100.1～0.5100100150100測定范圍（ng）1～2000.5～15100～500200～800200～500200～600批內(nèi)CV（%）3～94～83～563～71批間CV（%）5～108～103～9106～76正常值（g/L）1.0±0.21.5±0.21.2±0.21.2±0.11.2±0.21.7±0.2

P:多克隆抗體；M：單克隆抗體；RIA：放射免疫法；ELISA；酶聯(lián)免疫法；RID：單向免疫擴(kuò)散法；INA：免疫散射比濁法；ITA：免疫透射比濁法。

（源自：劉秉文，1995.）

表18-2 ApoAⅡ免疫測定法的比較

RIAELISAEIARIDINAITA抗體PP，MPPPP靈敏度（g）0.52053020測定范圍（ng）1～205～5030～6050～40050～90040～150批內(nèi)CV（%）785555批間CV（%）978-76正常值（g/L）0.25±0.40.35±0.050.76±0.20.29±0.020.37±0.090.36±0.03

（源自：劉秉文，1995.）

表18-3 ApoAⅣ免疫測定法的比較

RIAELISAEIA抗體PPP靈敏度（g）50.220測定范圍（ng）5～500.5～850～200批內(nèi)CV（%）53.605批間CV（%）789正常值（g/L）0.17±0.030.14±0.050.14±0.04

（源自：劉秉文，1995.）

表18-4 ApoB100免疫測定法的比較

RIAELISAEIARIDINAITA抗體P，MP，MPP，MPP靈敏度（n）5～102～2050～300300300300測定范圍（ng）0～1002～1020～50050～600300～500100～500批內(nèi)CV（%）4～84～71～73～74～72批間CV（%）7～11103～106～77～82正常值（g/L）0.9±0.20.85±0.10.6±0.30.8±0.20.8±0.20.8±0.3

（源自：劉秉文，1995.）

表18-5 ApoCⅠ免疫測定法的比較

RIAELISAINA抗體PPP靈敏度（n）1550測定范圍（ng）5～3015～100-批內(nèi)CV（%）735批間CV（%）958正常值（g/L）0.05±0.030.06±0.0020.06±0.01

（源自：劉秉文，1995.）

表18-6 ApoCⅡ免疫測定法的比較

RIAELISAEIARIDITA抗體PPPPP靈敏度（g）100.3454010測定范圍（ng）10～800.5～570～60040～60012～50批內(nèi)CV（%）636.52.13.3批間CV（%）1088.23.96.2正常值（g/L）0.04±0.010.033±0.0080.04±0.0020.039±0.0170.04±0.01

（源自：劉秉文，1995.）

表18-7 ApoCⅢ免疫測定法的比較

RIAELISAEIARIDINAITA抗體PPPPPP靈敏度（g）10.310762015測定范圍（ng）2～201～620～8076～60050～40030～120批內(nèi)CV（%）134.382.56.35.2批間CV（%）134.383.56.35.2正常值（g/L）0.15±0.060.16±0.030.12±0.040.127±0.0370.12±0.030.11±0.03

（源自：劉秉文，1995.）