《中國生物制品規(guī)程》 結(jié)核菌素純蛋白衍化物（TB-PPD）制造及檢定規(guī)程

本品系用結(jié)核桿菌經(jīng)液體表面培養(yǎng)、蒸汽殺菌過濾除去菌體，用沉淀分離、洗滌及再溶解的提純方法制成的液體或凍干制品，含有從結(jié)核桿菌培養(yǎng)濾液中獲得的活性物質(zhì)，其主要成分是蛋白質(zhì)，對已受結(jié)核菌感染或曾接受卡介苗免疫的機體，能引起特異的皮膚變態(tài)反應。用于檢查結(jié)核桿菌的感染及觀察免疫反應。

1　菌種

1.1　菌種由中國藥品生物肉制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。

1.2　制造TB-PPD用人型結(jié)核桿菌，菌號93009（H37Rv）。菌種應有完整的歷史資料，經(jīng)過全面檢定，凍干保存。

1.3　應制備生產(chǎn)用菌種批，次級菌種批應控制在5代以內(nèi)。

2　制造

全部生產(chǎn)過程，包括殺死分枝桿菌，應在完全隔離的區(qū)域內(nèi)用專用設(shè)備進行。

2.1　制造用培養(yǎng)基

使用蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基，改良蘇通綜合培養(yǎng)基，或其他適宜培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中應不含已知能對人或動物造成毒性和變態(tài)性反應的成分。

2.2　啟開菌種（菌種批）反接種于蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基上。置37℃培養(yǎng)2～3周，可在蘇通馬鈴薯培養(yǎng)基上再傳一代或直接挑取蘇通馬鈴薯管內(nèi)生長良好的菌膜，移種于改良蘇通綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基的表面，置37℃靜止培養(yǎng)1～2周，供大量接種用。

2.3　大量接種

挑取發(fā)育良好的菌膜移種于改良蘇通綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基的表面，置37℃靜止培育8～10周。凡在培養(yǎng)期間或培養(yǎng)終止時，有菌膜下沉、發(fā)育異常或污染雜菌者，必須廢棄。

2.4　殺菌

培養(yǎng)終止，將培養(yǎng)物加熱，121℃30分鐘進行殺菌處理。

2.5　除菌

殺菌后用濾器除去菌膜及菌體，收集濾液并取樣做無菌試驗，然后，加入0.3%苯酚或其他適宜的防腐劑。濾液保存在4～8℃，但要防止凍結(jié)。

2.6　提純

用三氯乙酸和飽和硫酸銨法分別沉淀蛋白，加壓過濾除去清液，并收集沉淀物于3μm孔徑的濾膜上，然后用10%氯化鈉液洗酸脫鹽至中性為止，最后以磷酸鹽緩沖液將沉淀物溶解，除菌過濾后即為原液。亦可采用其他適宜方法提純。

2.7　分批

每次提純的原液作為1亞批。最多將5個亞批混合組成為1批。

2.8　半成品檢定

2.8.1　物理檢查

原液應為深棕色的澄明液體，不應有沉淀物或其他雜質(zhì)。

2.8.2　無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

2.8.3　安全試驗

用體重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射原液1.0ml，觀察6周，檢查其癥征或死亡。所有在試驗后24小時內(nèi)死亡的或表現(xiàn)出癥征的動物應作鏡檢，然后將有關(guān)的組織鏡檢和培養(yǎng)，檢查其有無分枝桿菌存在的證據(jù)。觀察期中活存的動物也要以同樣方法檢查。

如果分析桿菌活菌培養(yǎng)試驗陰性，在觀察期中全部豚鼠健康存活，無一動物出現(xiàn)分枝桿菌的癥征，則可判定濃縮原液通過試驗。

如果未到觀察期，任何動物死于非結(jié)核病因，本試驗可復試一次。

2.8.4　致敏效應試驗

實驗組與對照組分別用體重300～400g未做過任何試驗的健康豚鼠各3只，實驗組每只豚鼠皮內(nèi)注射0.1ml含500IUTB—PPD樣品，共3次，每次間隔5天，在第3次注射后15天，實驗組與對照組每只豚鼠各皮內(nèi)注射0.1ml含500IUTB—PPD樣品，連續(xù)觀察3天，兩組動物反應不應有明顯區(qū)別。

2.8.5　純度測定

應測定蛋白（凱氏定氮法）、多糖（蒽酮法）與核酸（紫外分光光度法）含量。蛋白含量應≥90%，多糖含量≤3%。

2.8.6　效價測定

TB—PPD標準品由中國藥品生物制品檢定所提供。

2.8.6.1　動物試驗

將標準品及待檢原液分別稀釋馬0.1ml含100IU、20IU及4IU或其他適宜的稀釋度，用體重400～600g已致敏的白色雌性豚鼠最少4只，去毛后于背部脊柱兩側(cè)相對部位，分別皮內(nèi)注射上述稀釋度各0.1ml（從尾側(cè)起先注射稀釋度最高者）。于注射后24、48小時各觀察結(jié)果1次（可根據(jù)48小時的反應結(jié)果判定），算出待檢和標準TB-PPD的平均硬結(jié)反應（縱橫直徑相加除2）計算累計值，并求其比值，比值1±0.2者為合格。

也可按WHO規(guī)程要求，標準品及待檢樣品分別稀釋3個不同的適宜稀釋度，用6只致敏豚鼠，以輪圈法注射于豚鼠背部兩則，每側(cè)3點，每點皮內(nèi)注射0.1或0.2ml樣品，用雙盲法分別記錄24及48小時局部硬結(jié)的縱徑與橫徑。計算每個稀釋度2天的總和（也可計算2天的平均面積），并求其比值，比值1±0.2者為合格。

稀釋度的選擇應能使注射后24小時所產(chǎn)生的局部硬結(jié)反應直徑不小于8mm，不大于25mm，兩個樣品的反應直徑大致相同及兩個樣品的3個稀釋度的劑量對數(shù)反應線應基本平行。

如待檢樣品效價與標準品效價不一致，可用同樣方法重試一次，并算出相當于標準品的效價進行調(diào)整，調(diào)整后再重新抽樣測定效價，直至合格。

2.8.6.2　人體反應測定

動物試驗合格后，應進行小量人體測定，選擇對TB—PPD1IU（好0.02μg結(jié)核蛋白）反應陽性的敏感成人最少5人或者皮內(nèi)接種卡介苗12周后免疫效果觀察的嬰幼兒至少20人，每人于兩前臂內(nèi)側(cè)相對部位分別注射5IU的標準品與待檢樣品各0.1ml，注射后72小時觀察結(jié)果，并求其比值（計算方法與2.8.6.1項相同）。比值1±0.2，并無1例異常反應者為合格。

2.9　分裝凍干

經(jīng)物理檢查、無菌試驗、安全試驗、致敏效應試驗、蛋白質(zhì)含量及效價測定合格后，即可根據(jù)蛋白質(zhì)含量將原液進行定量稀釋至規(guī)定濃度，然后定量分裝安瓿，每安瓿裝量為0.5ml，分裝后立即進行凍干。每安瓿的分裝誤差應符合標準品的要求（差異系數(shù)不超過1%）。

凍干后抽樣做成品檢定，亦可將原液保存?zhèn)溆谩?/p>

3　濃縮物檢定

3.1　物理檢查

凍干TB—PPD應為白色疏松體，無融化跡象。加入稀釋液后，應于3分鐘內(nèi)全部溶解，呈棕黃色澄明液體，不得有不容物或雜質(zhì)。

如系液體原液，亦應為棕黃色澄明液體，不應有不溶物或雜質(zhì)。

3.2　水分測定

凍干制品水分含量應≤3%。

3.3　無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

3.4　安全試驗

按2.8.3項進行。

3.5　純度測定

按2.8.5項進行。

3.6　致敏效應試驗

按2.8.4項進行。

3.7　效價測定

動物試驗按2.8.6.1項進行。人體反應測定按2.8.6.2項進行。但觀察人數(shù)需增加1～2倍。

3.8　保存與效期

保存于2～8℃冷暗處。凍干制品自效價測定合格之日起效期為10年。液體原液自效價測定合格之日起效期為5年。

4　TB—PPD和稀釋

4.1　稀釋

經(jīng)檢定合格的濃縮物用內(nèi)含0.0005%吐溫80及0.3%苯酚的pH7.2～7.4的0.01mol的磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至20IU或50IU。

各處稀釋用具應專用。加入TB—PPD后應充分搖勻，并逐瓶抽樣作無菌試驗，合格后分裝。

4.2　分批

每次稀釋的同一濃度的稀釋TB—PPD為一批，同時有數(shù)瓶者，按瓶分為亞批。

4.3　分裝

由專人用專用工具進行。

5　成品檢定

5.1　物理檢查

分裝后應進行破漏、裝量、外觀檢查。應為無色澄明液體，不得有不容物或雜質(zhì)。

5.2　化學檢查

pH值應為6.8～7.4。苯酚含量應為0.25%～0.5%。

5.3　無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

5.4　防腐劑試驗

用體重18～20g小白鼠2只，各皮下注射樣品0.5ml，小白鼠震顫時間不得超過半小時，觀察7天，不得有局部膿腫或死亡。

5.5　安全試驗

每批用體重18～20g小白鼠5只，各腹腔注射樣品0.5ml，觀察1周，小白鼠應健康活存。

5.6　效價測定

按2.8.6.1項進行。比值1±0.2者為合格。

6　保存與效期

保存于2～8℃暗處。自稀釋檢定合格之日起效期為1年。