《中國生物制品規(guī)程》 凍干流行性腮腺炎活疫苗制造及檢定規(guī)程

本品系用流行性腮腺炎病毒減毒株接種雞胚細(xì)胞，經(jīng)培育、收獲病毒液后凍干制成。用于預(yù)防流行性腮腺炎。

1　毒種

1.1　毒種來源

應(yīng)用經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)符合疫苗制造要求的流行性腮腺炎病毒上海S79減毒株或其他減毒株。由中國藥品生物制品檢定所或衛(wèi)生部指定的其他單位保管、分發(fā)。毒種來源、減毒過程歷史應(yīng)清楚。經(jīng)純毒試驗(yàn)證明為流行性肋腺炎病毒，無外源因子污染，經(jīng)臨床觀察證明安全有效。傳代不應(yīng)超過國家檢定部門批準(zhǔn)的代數(shù)，并凍干保存于-20℃以下。

1.2　毒種檢定

由制造部門會同質(zhì)量檢定部門進(jìn)行。

1.2.1　無菌試驗(yàn)

按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。由合并的生產(chǎn)毒種批取樣不得少于總量的1%。加抗生素者，先將樣品置20～25℃增菌2～4天，再移種培養(yǎng)基。剩余的樣品分裝2小瓶，分別放30～35℃或20～25℃培育。檢查需、厭氧菌及霉菌，培育8天判定結(jié)果。加抗生素者，由開始增菌時算起。檢查支原體于35～37℃培育14天判定結(jié)果，陽性者不重試。

1.2.2　病毒滴定

取樣品做10倍系列稀釋，每個稀釋度病毒液接種雞胚細(xì)胞或其他適宜的傳代細(xì)胞，于適宜溫度培育8～10天判定結(jié)果（可用雞胚細(xì)胞作血吸附試驗(yàn)判定）。病毒滴度不得低于5.5LogCCID50/1.0ml。應(yīng)用病毒參考品同時進(jìn)行滴定（參考品由檢定所供應(yīng)）。

1.2.3　純毒試驗(yàn)

用經(jīng)稀釋的腮腺炎抗血清與一定量的病毒液等量混合后，置37℃水浴60分鐘，接種雞胚細(xì)胞或其他適宜的傳代細(xì)胞，37℃培育7～8天判定結(jié)果。腮腺炎病毒應(yīng)完全被中和，并不應(yīng)有其他病變出現(xiàn)（抗血清參考品由檢定所供應(yīng)）。

1.2.4.外源因子檢查

1.2.4.1　血吸附病毒檢查

每消化批細(xì)胞應(yīng)留5%（不少于500ml）用為細(xì)胞對照，觀察細(xì)胞病變至少14天。取其中25%培養(yǎng)瓶于第7天時用0.2%～0.5%雞、豚鼠混合紅細(xì)胞進(jìn)行血吸附試驗(yàn)，先于4～8℃放置30分鐘后判定，如為陰性，再移至20～25℃放置30分鐘判定結(jié)果，應(yīng)為陰性。凡有可疑細(xì)胞病變或血吸附試驗(yàn)可疑陽性者，應(yīng)用同種不同批細(xì)胞進(jìn)行盲傳。

1.2.4.2非血吸附病毒檢查

在對照細(xì)胞觀察結(jié)束時，取10ml細(xì)胞培養(yǎng)合并液接種同種不同批制備種子批用的細(xì)胞，另取10ml接種人源和猴源細(xì)胞，同時各留一瓶人源和猴源細(xì)胞作對照，置35～37℃觀察14天，應(yīng)無異常。

1.2.5　免疫原性檢查

取檢定代毒種批制成疫苗，按常規(guī)接種易感兒，免疫前及免疫后1個月采血，測定血抑抗體或中和抗體，每次檢查至少要包括免前抗體陰性（＜1∶2）者20名。抗體陽轉(zhuǎn)（免后抗體≥1∶2）率不應(yīng)低于95%，并不應(yīng)有腮腺腫大等反應(yīng)。

1.3　毒種傳代

應(yīng)按各毒株的培育條件進(jìn)行傳代，以保持其特性。疫苗所用的毒種代次應(yīng)在國家檢定部門許可范圍內(nèi)。生產(chǎn)毒種批不得通過任何傳代細(xì)胞系。

1.4　毒種保存

1.4.1必須選擇早代毒種批進(jìn)行凍干保存。

1.4.2液體毒種批需加5%～10%滅能小牛血清，置-60℃以下保存。

1.5　生產(chǎn)用毒種

檢定合格的毒種批可再傳遞10代，10代以內(nèi)只做上述1.2.1～1.2.3項(xiàng)檢定。

2　疫苗制造

2.1　細(xì)胞制備

選用來自SPF雞群的9～10日齡雞胚，經(jīng)胰蛋白酶消化分散。同一容器內(nèi)制備的細(xì)胞為1個消化批。

2.2　使用液體

生長液為含適量滅能小牛血清乳蛋白水解物歐氏液或經(jīng)國家檢定部門批準(zhǔn)的其他適宜培養(yǎng)液。

2.2.1疫苗生產(chǎn)過程中不得加青霉素或其他β-內(nèi)酰胺類抗生素。

2.3　培育方法

以適量病毒接種雞胚單層細(xì)胞，置33℃培育，當(dāng)出現(xiàn)“+”病變時，傾去培養(yǎng)液，用不少于原培養(yǎng)液量的洗液洗滌細(xì)胞表面，并換以疫苗液，當(dāng)病變達(dá)+++、++++時，放2～8℃或用其他適宜方法釋放病毒。

2.4　外源因子檢查

每消化批細(xì)胞留5%（不少于500ml）作為細(xì)胞對照，觀察細(xì)胞病變至少14天，取其中25%培養(yǎng)瓶于第7天時用0.2%～0.5%豚鼠和雞紅細(xì)胞混合液進(jìn)行血吸附試驗(yàn)，先于4～8℃放置30分鐘后判定，如為陰性再移至20～25℃放置30分鐘判定結(jié)果，應(yīng)為陰性。凡有可疑細(xì)胞病變或血吸附試驗(yàn)可疑陽性者，應(yīng)用同種不同批的細(xì)胞進(jìn)行盲傳。

2.5　半成品檢定

釋放病毒后按每1培養(yǎng)瓶或合并批為1批，及時抽樣進(jìn)行檢定。

2.5.1病毒滴定

方法同1.2.2項(xiàng)。凍干前滴度不得低于4.75LogCCID50/1.0ml。

2.5.2　無菌試驗(yàn)

按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。支原體檢查與質(zhì)量檢定部門會同進(jìn)行。

2.5.3　純毒試驗(yàn)

每一消化批應(yīng)抽樣進(jìn)行純毒試驗(yàn)。方法同1.2.3項(xiàng)。

2.6　疫苗凍干

半成品檢定合格后按比例加適宜保護(hù)劑，及時進(jìn)行分裝，分裝時置冰浴中保冷，采用適宜的凍干條件進(jìn)行凍干。封口時間不得超過4小時，亦可采用其他適宜封口方法。

2.7　包裝

按《生物制品包裝規(guī)程》進(jìn)行。

3　成品檢定

3.1　物理檢查

應(yīng)為乳酪色疏松體，溶解后應(yīng)為橘紅色透明液體，無異物。

3.2　無菌試驗(yàn)

按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，成品不做支原體檢查。

3.3　殘余水分含量

凍干疫苗殘余水分應(yīng)≤3.5%。

3.4病毒滴定及穩(wěn)定性試驗(yàn)

每批成品疫苗必須同時做病毒滴定及37℃放置7天進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。取3～5支樣品混合滴定，方法同1.2.2項(xiàng)。疫苗滴度于37℃放置7天前后均不得低于4.0LogCCID50/1.0ml。37℃7天后滴度下降不得超過1Log。

3.5　安全試驗(yàn)

用體重14～16g小白鼠4只，每只腹腔注射0.5ml，注射后密切觀察3天，應(yīng)健存。

3.6　殘余牛血清蛋白含量測定

用檢定所認(rèn)可的試劑和方法測定，殘余牛血清蛋白含量應(yīng)≤　50ng/ml。

4　疫苗稀釋液

滅菌注射用水，其質(zhì)量應(yīng)符合《中國藥典》規(guī)定。

5　保存與效期

應(yīng)保存于8℃以下。運(yùn)輸應(yīng)在冷藏條件下進(jìn)行。疫苗自病毒滴定合格之日起效期為1年半。