《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》 二、細(xì)胞免疫的體外檢測方法

體外檢測淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能，最易采集的是血標(biāo)本，首先需分離或純化淋巴細(xì)胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細(xì)胞分層液，當(dāng)將血液重疊于淋巴細(xì)胞分層液之上離心時，由于紅細(xì)胞（1.092）、多形核白細(xì)胞（1.090）、淋巴細(xì)胞（1.070）的比重不同而相互分開。淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細(xì)分出這一薄層的細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞占80%，單核細(xì)胞占20%，淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞占80%，B細(xì)胞占4%～10%，其作為非DT、非B細(xì)胞。

1．T細(xì)胞計數(shù)

（1）E花環(huán)法：人類T細(xì)胞表面有SRBC受體（CD2）能與SRBC結(jié)合形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，將經(jīng)分層液分離現(xiàn)的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合，經(jīng)37℃培養(yǎng)5～10分鐘放4℃過夜，取細(xì)胞懸計數(shù)，外周血淋巴細(xì)胞中約70%～80%淋巴細(xì)胞結(jié)成花環(huán)即為T細(xì)胞。目前此方法已用來分離T細(xì)胞，而不用做T細(xì)胞計數(shù)。

（2）用單克隆抗體計數(shù)T細(xì)胞：將人的PBM分成三等份，分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細(xì)胞結(jié)合，再用FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進(jìn)行間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下或流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，在PBM中被CD3抗體染上熒光的細(xì)胞稱為CD3+細(xì)胞即總T細(xì)胞。正常人在PBM中T細(xì)胞占70%～80%。正常人的CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞之和應(yīng)與CD3+細(xì)胞數(shù)一致。CD4+細(xì)胞與CD8+細(xì)胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小于1.7。

2．T細(xì)胞活化試驗T細(xì)胞能被非特異的物質(zhì)稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。T細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，最圖導(dǎo)致細(xì)胞分裂。在光學(xué)顯微鏡下可計數(shù)轉(zhuǎn)化后的淋巴細(xì)胞數(shù)，也可用氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）摻入正在分裂的淋巴細(xì)胞，用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細(xì)胞，用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的檢查法，稱為MTT檢測法，MTT是一種甲氮唑鹽，它是細(xì)胞線粒體脫氫酶的底物，細(xì)胞內(nèi)的酶可將MTT分解產(chǎn)生藍(lán)黑色甲（fromazan）產(chǎn)物。該產(chǎn)物的多少與活性細(xì)胞數(shù)正相關(guān)。結(jié)果可用酶標(biāo)檢測儀（595mm）測量匯豐銀行密度，做為MTT法的檢查指標(biāo)。此法的結(jié)果與3H-TdR摻入法平行，并能反應(yīng)試驗中的活細(xì)胞數(shù)（表20-3）。

表20－3　淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的刺激物

注： PWH主要是T細(xì)胞分裂原，也可通過刺激T細(xì)胞分泌可溶性因子誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖分化；

﹡SPA誘導(dǎo)B細(xì)胞分裂不需要T細(xì)胞協(xié)助，但誘導(dǎo)B細(xì)胞激活抗體分泌細(xì)胞需要T細(xì)胞協(xié)助

3．細(xì)胞毒試驗TC細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞對其靶細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒（殺傷）作用。常用的栓測細(xì)胞毒效應(yīng)的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細(xì)胞胞混合，于37℃培養(yǎng)1小時左右，51Cr即可進(jìn)入靶細(xì)胞，與胞漿蛋白結(jié)合，洗去游離的51Cr后，即可得到51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞，將待檢細(xì)胞毒性的細(xì)胞與51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞混合（比例約為50：1或100：1）靶細(xì)胞被殺傷越多，釋放到上清液中的液游離的51Cr越多，且不能被其他細(xì)胞吸收。用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值，即可計算出待檢細(xì)胞殺傷活性的高低。

細(xì)胞毒試驗檢測Tc細(xì)胞效應(yīng)功能是否健全，及經(jīng)IgG介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)，或NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。

4．混合淋巴細(xì)胞的反應(yīng)（MIR）是體外研究T細(xì)胞的較好的方法，雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細(xì)胞分別與病人的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)4～5天，在最后8小時摻入51TdR摻入法測T細(xì)胞的反應(yīng)性?；蛴眉?xì)胞毒法觀察受刺激的T細(xì)胞與活的靶細(xì)胞混合（靶細(xì)胞來自與刺激細(xì)胞相同的個體）如果T細(xì)胞受刺激后產(chǎn)生了細(xì)胞毒T細(xì)胞，可殺死活的細(xì)胞，根據(jù)靶細(xì)胞釋放51Cr的多少算出T細(xì)胞移動抑制因子）和LIF（白細(xì)胞移動抑制因子）來評估細(xì)胞免疫功能。近年來應(yīng)用測定IL-2的免疫酶技術(shù)，操作簡單，并能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個核細(xì)胞與分裂原一起培養(yǎng)24小時，然后測定清液中的IL-2活性。在細(xì)胞免疫功能缺損時，特別是AIDS病人，IL-2分泌明顯降低。而有些疾病，如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、移植排斥反應(yīng)等病人體內(nèi)血清中IL-2水平升高，表明病人T細(xì)胞活性增高。發(fā)生移植排斥反應(yīng)的病人尿中IL-2也可升高。

也可用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定各種體液中活化的T細(xì)胞脫落的IL-2受體（CD25），一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的，IL-2和IL-2受體的檢測可用于對某些疾病的監(jiān)測，如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。

對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子產(chǎn)生能力檢測是檢查細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的生物活性或抗原性?，F(xiàn)已可用核酸雜交技術(shù)，即從組織中或細(xì)胞中提取RNA，與同位素或酶標(biāo)記的該種細(xì)胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗，即印跡（dot blotting）或Northern印跡，若查出有某種因子的mRNA存在，即說明該細(xì)胞在所處培養(yǎng)條件下有產(chǎn)生某種細(xì)胞因子的能力。