中國(guó)醫(yī)科院醫(yī)藥生技所建立三種新藥篩選平臺(tái)并確定相關(guān)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

近年來(lái)，基于新作用靶點(diǎn)建立新的藥物高通量篩選方法、模型的研究明顯增多，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)（現(xiàn)更名為北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）醫(yī)藥生物技術(shù)研究所在這方面取得卓有成效的進(jìn)展：以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶（TK）為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)建立了其抑制劑的高通量篩選模型；研究建立了以人骨形態(tài)形成蛋白因子Ⅱ（BMP-2）為作用靶點(diǎn)的抗骨質(zhì)疏松藥物篩選模型；建立了由土壤真菌篩選抗凝血因子X(jué)a的快速高通量篩選方法等，并利用這些新的篩選方法、模型篩選到了若干陽(yáng)性菌株，分離、鑒別了一批次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性和結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了有活性的抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松以及心血管病作用等的化合物。

EGFR在多種上皮性腫瘤中存在過(guò)度表達(dá)，如非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌、頭頸癌等。EGFR的表達(dá)與細(xì)胞惡變，腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成相關(guān)。

首先，研究人員進(jìn)行了具胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)功能的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶的克隆表達(dá)及其抑制劑高通量篩選模型的構(gòu)建研究。他們根據(jù)已知的EGFRcDNA序列設(shè)計(jì)編碼了EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)的引物，并在引物的5’末端分別引入KpnI和HindIII限制性酶切位點(diǎn),以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR獲得編碼EGFR胞內(nèi)酪氨酸激酶的基因片段cDNA。將其插入大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a，獲得重組質(zhì)粒pET-TK，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，測(cè)序結(jié)果與已知E-GFR基因編碼序列比較完全一致。進(jìn)一步研究結(jié)果表明,所表達(dá)的重組EGFR-TK主要以包涵體的形式存在。研究人員對(duì)包涵體重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，并采用組氨酸親和層析柱純化，同時(shí)對(duì)蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究，終于構(gòu)建成功酪氨酸激酶抑制劑的高通量篩選模型。

研究人員將進(jìn)一步對(duì)化合物和微生物菌株進(jìn)行篩選，以獲得具有EGFR-TK抑制活性的化合物，為新的抗腫瘤藥物研究奠定基礎(chǔ)。

其次，該所微生物新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員，建立了以人骨形態(tài)形成蛋白因子Ⅱ（BMP-2）為作用靶點(diǎn)的抗骨質(zhì)疏松藥物篩選模型，并深入進(jìn)行了諾卡菌屬菌株04-5195的鑒別及所產(chǎn)生的BMP-2上調(diào)活性物質(zhì)的研究。

骨質(zhì)疏松的發(fā)生是由于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡被打破，骨溶解超過(guò)骨形成所致。以往的研究與治療方案大多是針對(duì)破骨細(xì)胞以控制骨質(zhì)的損失，但大量的臨床病例證明，促進(jìn)骨的形成是治療骨質(zhì)疏松癥的根本措施所在，也就是通過(guò)改善骨質(zhì)的形成代謝，增強(qiáng)成骨細(xì)胞作用，最終達(dá)到恢復(fù)患者正常骨水平的目的。

成骨細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、分化受多種因素的調(diào)節(jié)，其中BMP-2在成骨細(xì)胞的分化過(guò)程中起非常重要的作用。研究人員建立了以人bmp-2啟動(dòng)子為作用靶點(diǎn)的促BMP－2上調(diào)的抗骨質(zhì)疏松藥物篩選新模型，以熒光素酶的表達(dá)量作為樣品促bmp-2基因表達(dá)的檢測(cè)指標(biāo)。并應(yīng)用該模型篩選了5000多個(gè)微生物發(fā)酵粗品和500個(gè)合成化合物，從中獲得若干陽(yáng)性發(fā)酵樣品和化合物。

其中，菌株04-5195是從我國(guó)濟(jì)南四方塔采集的土樣中分離得到的一株放線菌。研究人員對(duì)其進(jìn)行多相分類研究并與已知相關(guān)菌株比較，發(fā)現(xiàn)該菌株具有典型的諾卡菌屬菌種的形態(tài)學(xué)特征；對(duì)其表型和基因型進(jìn)行綜合分析，表明該菌株為諾卡菌屬的一個(gè)新種，將它定名為濟(jì)南諾卡氏菌新種(Nocardia jinanensis sp.nov.)。進(jìn)一步對(duì)該菌株進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵，發(fā)酵濾液用型號(hào)為7.5×60厘米的X-5大孔樹(shù)脂柱粗提取，50％和80％丙酮洗脫，分部收集并測(cè)定生物活性。活性部分合并濃縮后，經(jīng)型號(hào)為3.5×30厘米硅膠柱分離，收集活性成分并經(jīng)ODS柱多次純化，直至得單一活性組分。研究發(fā)現(xiàn)，此單一活性組分為非Statin類化合物，最大紫外吸收波長(zhǎng)在318納米，具有高上調(diào)bmp-2啟動(dòng)子的活性。目前，研究人員正在對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

此外，該所研究人員還與華北制藥集團(tuán)新藥研發(fā)中心合作，建立了一個(gè)快速的高通量篩選方法，從大量土壤真菌代謝產(chǎn)物中篩選Xa因子抑制劑，并得到陽(yáng)性菌株F03-766。

抗凝血藥是一類干擾凝血因子、阻止血液凝固的藥物，主要用于血栓栓塞性疾病的防治。凝血因子的級(jí)聯(lián)活化是導(dǎo)致血液凝固的觸發(fā)機(jī)制，其中因子X(jué)被激活為Xa是此過(guò)程的關(guān)鍵步驟。Xa因子只單純促進(jìn)凝血，沒(méi)有凝血酶抑制劑的副作用，因而成為近年來(lái)抗凝血藥物研究的熱點(diǎn)之一。

研究人員建立了一種精確、快速的高通量的Xa因子抑制劑的體外篩選模型，從真菌次生代謝產(chǎn)物中篩選到一株陽(yáng)性菌株F03-766。該菌株的發(fā)酵液經(jīng)有機(jī)溶劑提取、硅膠柱色譜、ODS柱色譜、SephadexLH-20柱色譜及HPLC制備分離，得到4個(gè)活性化合物F03-766A、B、C、D，均對(duì)因子X(jué)a有較強(qiáng)活性，其IC50分別是0.58微克/毫升、0.70微克/毫升、0.72微克/毫升、0.75微克/毫升。據(jù)悉，進(jìn)一步的抗凝血評(píng)價(jià)工作正在進(jìn)行之中。