中藥復(fù)方消癌根對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠60只，4～6周齡，體重18～22g，雄性，購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前分籠飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由攝食、飲水，鼠房保持通風(fēng)，室溫保持在25±2℃，光照周期12/12小時(shí)。

（二）細(xì)胞株

細(xì)胞株為小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株S180細(xì)胞，皮下接種可生成肉瘤。購于中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，常規(guī)復(fù)蘇傳代培養(yǎng)。

（三）主要藥物、試劑和儀器

中藥復(fù)方消癌根，由董草原醫(yī)生提供。

環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)02071121。

（四）消癌根藥液的制備

消癌根是由純中藥粉碎而得的黑褐色藥粉。根據(jù)人與小鼠藥物劑量換算公式：d小鼠=d人×（k小鼠/k人），（k小鼠、k人分別為小鼠和人的折算系數(shù)）算出小鼠每日給藥劑量。取體重為50kg正常成人每日口服消癌根劑量為9g，算得小鼠每日給藥低劑量，再將其劑量增加一倍設(shè)為高劑量；然后算出藥液所要濃度。用蒸餾水將消癌根分別配成每毫升含0.10g、0.05g生藥的高、低兩個(gè)劑量組的懸濁液，4℃冰箱保存，用時(shí)搖勻。

用無菌生理鹽水將環(huán)磷酰胺稀釋成為2mg/ml，4℃冰箱保存。

（五）荷瘤小鼠模型的建立

體外復(fù)蘇培養(yǎng)S180細(xì)胞：將S180細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血精的RPMI-1640營養(yǎng)液（含青霉素100×103?滋/L和鏈霉素100mg/L）中，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。該細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.5%胰蛋白酶消化，機(jī)械吹打成細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次，2000r/min離心5min，棄上清液，用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整到2×106/ml～3×106/ml個(gè)瘤細(xì)胞，隨機(jī)先取5只健康昆明種小鼠，每只用上述細(xì)胞懸液0.4ml腹腔注射，注意觀察接種小鼠腹水生長(zhǎng)情況，約1周后接種小鼠腹部明顯增大、凸出。將其頸椎脫臼處死，固定于蠟板上，無菌抽取乳白色腹水液，以0.9%氯化鈉溶液1：1稀釋，經(jīng)0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)算活細(xì)胞數(shù)﹥95%，調(diào)整瘤細(xì)胞懸液濃度為6×106/ml個(gè)瘤細(xì)胞，每只小鼠右后肢臀部皮下接種0.2ml。共接種44只小鼠。24小時(shí)后用藥。

（六）實(shí)驗(yàn)分組和給藥

將44只造模成功的小鼠隨機(jī)分為4組，每組11只，組內(nèi)編號(hào)。4組分別為：消癌根高劑量組、消癌根低劑量組、陰性對(duì)照組及環(huán)磷酰胺組。所有處理自造模第二天開始：消癌根高、低劑量組分別按24g·kg-1·d-1、2g·kg-1·d-1灌胃，陰性對(duì)照組給相同劑量的蒸餾水灌胃，環(huán)磷酰胺組按20mg·kg-1·d-1腹腔注射。連續(xù)用藥15天后停藥，處死小鼠，剝離瘤塊，用濾紙吸干后，稱取瘤重。

（七）評(píng)定指標(biāo)

（1）腫瘤抑制百分率（抑瘤率）：

抑瘤率（%）=（陰性對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重）／（陰性對(duì)照組平均瘤重）×100%

（2）給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺由體外測(cè)出瘤體的長(zhǎng)徑和短徑，然后根據(jù)體積=長(zhǎng)徑×短徑2，繪出腫瘤生長(zhǎng)圖。

（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，實(shí)驗(yàn)資料采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。

結(jié) 果

（一）瘤重和抑瘤率

消癌根對(duì)S180移植性腫瘤的抑制作用。消癌根高劑量組和消癌根低劑量組與陰性對(duì)照組比較，其瘤重均顯著減輕（P﹤0.05）；消癌根高劑量組的瘤重與消癌根低劑量組比較亦明顯減輕（P﹤0.05）；消癌根高劑量組與環(huán)磷酰胺組比較其瘤重有顯著性差異（P﹤0.05）；環(huán)磷酰胺組抑瘤率最高。

（二）腫瘤的生成曲線

以時(shí)間為橫軸，腫瘤體積為縱軸繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線。

討論

（一）小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株S180細(xì)胞的選擇

國內(nèi)研究者對(duì)S180生物學(xué)特性、免疫學(xué)、細(xì)胞系的建立及移植實(shí)驗(yàn)條件等方面做了較為深入的研究。由于其造模時(shí)間短、接種成功率高的特點(diǎn)，均一性好，目前此模型已廣泛地用于腫瘤基礎(chǔ)研究及藥物篩選，成為研究中醫(yī)藥抗腫瘤的作用及機(jī)制的一個(gè)公認(rèn)的腫瘤模型。

本實(shí)驗(yàn)采用購自中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所的S180細(xì)胞，進(jìn)行小鼠皮下腫瘤造模。經(jīng)過對(duì)S180細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代，右后肢臀部皮下接種，成功地造出44只荷瘤小鼠，造模成功率達(dá)100%。這一模型具有明顯外部特征，容易觀察、測(cè)量皮下瘤塊的生長(zhǎng)情況，以反映出各實(shí)驗(yàn)組的藥效。另外，本實(shí)驗(yàn)中的荷瘤小鼠皮下腫瘤易剝離，以便較為精確地稱重、計(jì)算抑瘤率。

（二）消癌根對(duì)腫瘤的抑制作用

本實(shí)驗(yàn)擬考察消癌根的抗腫瘤效果，以S180荷瘤小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將環(huán)磷酰胺設(shè)為陽性對(duì)照藥，生理鹽水組作為陰性對(duì)照組進(jìn)行操作。環(huán)磷酰胺是臨床常用的化療藥，其能有效地殺傷癌細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)其抑瘤率達(dá)到45.6%）。藥效方面，消癌根高劑量組抑瘤率達(dá)到35.2%，消癌根低劑量組亦達(dá)到22.1%，消癌根高劑量組平均瘤重與低劑量組平均瘤重存在顯著性差異（P﹤0.05）。這說明消癌根在抗腫瘤方面有一定療效，并且存在著一定的量效趨勢(shì)。

消癌根的抗腫瘤機(jī)理可能是通過抑制捐資血管生成來實(shí)現(xiàn)的。將在以下實(shí)驗(yàn)中予以探討。