砷劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

作者：宋鐵芳

砷劑，主要成分為三氧化二砷（As2O3），在祖國(guó)醫(yī)藥中被稱(chēng)為砒石。幾世紀(jì)以前，砷劑就被人們用來(lái)治療牛皮癬、風(fēng)濕癥、白血病、梅毒、痔瘡等。目前臨床上砷劑的應(yīng)用主要限于用有機(jī)砷治療錐蟲(chóng)病或三氧化二砷作牙髓失活劑。

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)首先報(bào)道了靜脈滴注As2O3治療復(fù)發(fā)的急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）達(dá)到很高的完全緩解率后，上海血液研究所發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡和部分分化。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)砷劑與腫瘤的研究發(fā)展很快，發(fā)現(xiàn)砷劑對(duì)惡性淋巴系統(tǒng)疾病、紅白血病甚至實(shí)體瘤有令人振奮的治療效果。現(xiàn)就其生化作用及對(duì)腫瘤的誘導(dǎo)凋亡作用作一綜述。

1　砷的生化作用

砷作為微量元素，存在于正常人體內(nèi)。其化學(xué)形式可分為三價(jià)砷(無(wú)機(jī)砷)和五價(jià)砷(有機(jī)砷)，它們?cè)隗w內(nèi)的相互轉(zhuǎn)換和代謝決定著砷的毒性作用。三價(jià)砷毒性較大，易在體內(nèi)蓄積，主要經(jīng)胃腸道緩慢排泄;而五價(jià)砷則相對(duì)毒性較低，蓄積傾向低，主要經(jīng)腎臟較快排泄。進(jìn)入人體后的三價(jià)砷在肝臟內(nèi)還原發(fā)生甲基化，形成一甲胂酸(MMA)或二甲胂酸(DMA)，從而被解毒。

砷是一種細(xì)胞原漿毒，細(xì)胞內(nèi)的相鄰巰基是三價(jià)砷的主要化學(xué)受體。應(yīng)用含巰基的還原型谷胱甘肽可阻斷砷劑的毒性作用。含大量巰基的還原型角蛋白結(jié)合砷劑的量為含較少巰基的氧化型角蛋白結(jié)合砷劑量的十倍。砷劑與酶分子內(nèi)的巰基作用后可抑制其活性。受影響的重要酶系統(tǒng)有丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、磷酸酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、脫氧核糖核酸聚合酶、白介素1β轉(zhuǎn)化酶（ICE）等，從而直接影響了細(xì)胞的代謝過(guò)程、染色體結(jié)構(gòu)、核分裂等。

線粒體是對(duì)砷劑作用最敏感的細(xì)胞器，三價(jià)砷消耗了線粒體內(nèi)親水的巰基后，干擾了線粒體內(nèi)的離子平衡以及NAD(P)H的氧化，從而干擾了線粒體的能量代謝，引起細(xì)胞功能的紊亂。砷劑是否對(duì)正常細(xì)胞有毒性作用取決于劑量，如As2O3治療APL有效血濃度及體外研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的有效濃度均在0.1μM～2.0μM，實(shí)驗(yàn)表明As2O3在此濃度下對(duì)造血干細(xì)胞影響甚小[1]。

2　砷劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)失控，分化或凋亡受阻。近年來(lái)研究表明砷劑既可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、部分分化，也可抑制其增殖。多項(xiàng)研究表明誘導(dǎo)凋亡為其殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制。

2.1　開(kāi)放MPT，活化caspase家族

研究表明，細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)不在細(xì)胞核而在細(xì)胞質(zhì)。雖然凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)一系列的特征性形態(tài)學(xué)變化，但這些改變僅僅是細(xì)胞凋亡的結(jié)果。凋亡細(xì)胞在被誘導(dǎo)產(chǎn)生特征性形態(tài)學(xué)改變和DNA降解之前，一個(gè)最普遍的變化是線粒體膜功能的改變即線粒體的通透性改變(permeability transition，PT)，這是調(diào)節(jié)凋亡的中心環(huán)節(jié)。線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道(MPT)是位于線粒體內(nèi)外膜之間的多蛋白復(fù)合體，至少包括胞質(zhì)的己糖激酶、外膜的PBR、外室的肌酸激酶、內(nèi)膜的ANT及基質(zhì)的親環(huán)蛋白D（cyclophilin D）等。

MPT通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體基質(zhì)中的Ca2＋、pH和電荷，維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保證氧化磷酸化通路通暢，對(duì)凋亡控制具有重要作用。砷劑與巰基結(jié)合后，導(dǎo)致MPT開(kāi)放，線粒體跨膜電位(△ψm)下降或消失，繼之呼吸鏈脫偶聯(lián)，谷胱甘肽耗竭，活性氧類(lèi)（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生及對(duì)誘導(dǎo)凋亡非常重要的蛋白酶活化物的釋放，包括細(xì)胞色素C(Cyto-C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)，

Cyto-C和 AIF均可激活caspase，caspase可誘導(dǎo)凋亡。

caspase即半胱氨酸蛋白酶家族。在NB4（一種APL細(xì)胞系），U937及SHSY5Y成神經(jīng)細(xì)胞瘤等細(xì)胞系中均可見(jiàn)As2O3等砷劑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)的caspase激活[2，3]。根據(jù)其在細(xì)胞凋亡中的作用可分為始動(dòng)(上游)caspase(caspase2，8，9，10)和效應(yīng)(下游)caspase(caspase3，6，7)兩大類(lèi)。前者在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)作用下結(jié)合特異輔因子而活化，并進(jìn)一步活化后者。而caspase抑制劑(ZVAD，fmk等)可阻止砷劑誘導(dǎo)的凋亡。因而caspase的活化級(jí)聯(lián)形式是砷劑誘導(dǎo)凋亡的重要通路。綜上所述，砷劑引起的MPT開(kāi)放和△ψm破壞是決定細(xì)胞生存與否的關(guān)鍵，而caspase是砷劑誘導(dǎo)凋亡的下游效應(yīng)物，其活化可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.2　改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)

細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和抗氧化代謝的平衡往往是決定細(xì)胞生存與否的關(guān)鍵。蛋白的氧化作用可能是改變核基因轉(zhuǎn)錄的重要步驟，氧化作用通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄改變細(xì)胞的表型以便進(jìn)一步啟動(dòng)凋亡的發(fā)生，且凋亡的最后階段需要氧化過(guò)程的參與，如細(xì)胞膜蛋白的氧化能開(kāi)放離子通道間接地導(dǎo)致細(xì)胞皺縮，通過(guò)組蛋白的氧化修飾作用導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的改變。砷劑可使細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多是由于：

（1）MPT開(kāi)放，線粒體內(nèi)氧化呼吸鏈?zhǔn)茏?，致ROS外漏。

（2）活化黃素蛋白依賴的超氧化物酶（如NADPH氧化酶），使H2O2產(chǎn)生增多，后者可通過(guò)從線粒體釋放Cyto-C，活化caspase-3并裂解多聚ADP核糖多聚酶(PARP)而介導(dǎo)凋亡（PARP在DNA受損時(shí)可識(shí)別并結(jié)合到DNA斷裂處被激活而參與DNA的修復(fù)，是細(xì)胞凋亡中第一個(gè)被鑒定為由caspase-3降解的DNA修復(fù)酶）；又可通過(guò)與線粒體巰基形成復(fù)合物而降低GSH的活性等途徑使ROS清除減少。故砷劑可通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)誘導(dǎo)凋亡。但將細(xì)胞培養(yǎng)于氧濃度低于10ppm不可能產(chǎn)生ROS的條件下，仍可發(fā)生凋亡，故這可能只是機(jī)制之一。

2.3　快速調(diào)變PMLRARα融合蛋白的亞細(xì)胞定位

APL細(xì)胞特征性染色體易位t(15;17)導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞白血病基因(PML)和維甲酸受體α基因(RARα)融合，表達(dá)PML-RARα融合蛋白。通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)可證實(shí)PML-RARα融合蛋白是APL發(fā)病的主要分子基礎(chǔ)。體外研究表明，PML-RARα融合蛋白既阻斷APL細(xì)胞的分化，也使APL細(xì)胞凋亡受阻。早期認(rèn)為砷劑通過(guò)降解此蛋白而誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡，稱(chēng)之為維甲酸受體信號(hào)通路[4]。

正常血細(xì)胞中野生型PML與RARα等共定位于核體(PODs)中。大多數(shù)APL細(xì)胞因PML-RARα與PML形成異二聚體而使PODs結(jié)構(gòu)解體，阻止細(xì)胞分化及抑制凋亡。砷劑使PML，PML-RARα重新共定位于PODs并快速降解之。該現(xiàn)象與APL細(xì)胞凋亡以及二硫鍵還原劑二硫蘇糖醇(DTT)抑制NB4細(xì)胞凋亡與抑制PML-RARα快速降解在時(shí)相上均有一定的相關(guān)性，被認(rèn)為是砷劑治療APL的機(jī)制之一。

但有實(shí)驗(yàn)顯示[5]，在PML－小鼠(不含PML基因的小鼠)，As2O3同樣能抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，且其誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)不僅見(jiàn)于APL細(xì)胞，還可見(jiàn)于非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞、慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞及某些正常細(xì)胞，故其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制是非特異性的，維甲酸受體信號(hào)通路并非是砷劑誘導(dǎo)凋亡的惟一機(jī)制。

2.4　抑制Bcl-2基因

Bcl-2基因即細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因[6～9]，是一種凋亡抑制基因，又稱(chēng)長(zhǎng)壽基因，是維持癌細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)的主要基因。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bax、Bcl-X、Bcl-w、Bak、Bad、A1、NR-13和Mcl-1，其中Bax、Bak、Bcl-Xs是促凋亡因子，其余為抗凋亡因子。Bcl-2對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響，而對(duì)細(xì)胞死亡的干擾有選擇性，阻止了細(xì)胞死亡的最后途徑，包括核苷酸內(nèi)切酶對(duì)DNA的降解。Bax是Bcl-2的一種同源蛋白，Bax既可以形成同聚體，又可與Bcl-2形成異二聚體，Bax蛋白與Bcl-2蛋白的比值影響著細(xì)胞受到刺激后發(fā)生凋亡的比率。

目前認(rèn)為，Bcl-2家族促凋亡因子和抗凋亡因子的相對(duì)表達(dá)水平至少部分決定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)性。大量實(shí)驗(yàn)表明，Bcl-2與Bcl-X l能夠抑制MPT開(kāi)放和維持線粒體△ψm，進(jìn)而抑制Cyto_C和AIF從線粒體釋放入胞漿并阻斷了ROS的生成，增加胞內(nèi)GSH含量并促進(jìn)其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，即有細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用。在砷劑誘導(dǎo)的NB4、U937及B細(xì)胞白血病細(xì)胞系LyH7細(xì)胞凋亡中Bcl-2表達(dá)下調(diào)[10]。

在1.0μM As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡時(shí)[11],CPP32（caspase3）被激活和降解PARP，同時(shí)Bcl-2不僅在mRNA水平而且在蛋白質(zhì)水平均被下調(diào)；而在1.0μM As2O3誘導(dǎo)惡性淋巴性白血病細(xì)胞凋亡過(guò)程中既無(wú)CPP32激活又無(wú)Bcl-2調(diào)變，提示砷劑誘導(dǎo)的凋亡中Bcl-2發(fā)揮的作用各異。有實(shí)驗(yàn)表明，2.5μM As2O3[12]使肝癌細(xì)胞系Hep201Bcl-2表達(dá)明顯下降，而凋亡的促進(jìn)因子Bax的表達(dá)明顯增加，兩種基因表達(dá)比例發(fā)生變化。

又有報(bào)道，10μM As2O3處理人肝癌QGY-5401、QGY-5403細(xì)胞48小時(shí)后其Bcl-2基因表達(dá)明顯下降，Bax和Fas基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bax蛋白與Bcl-2蛋白比值增加。對(duì)Bax、Bcl-Xl等基因是否表達(dá)各報(bào)道不同[13～15]。Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可抑制砷劑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)現(xiàn)象，而通過(guò)反義技術(shù)使Bcl-2下調(diào)可抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡。

綜上所述，砷劑可通過(guò)對(duì)Bcl-2基因的抑制誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的凋亡。但As2O3并不影響惡性淋巴瘤細(xì)胞及某些成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系Bcl-2（Bcl-Xl）的表達(dá)，提示Bcl-2可能不是參與誘導(dǎo)以上細(xì)胞凋亡的主要中介。

2.5　抑制NF-κB的活化

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor-κB）是1986年首先于B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)合于免疫球蛋白κ輕鏈增強(qiáng)子上的核蛋白[16]。在正常情況下，NF-κB與其抑制物IκBα結(jié)合，存在于細(xì)胞漿中，IκBα遮蔽著NK-κB的基因定位序列（NLS），NF-κB的生物學(xué)活性不表現(xiàn)出來(lái)。當(dāng)細(xì)胞受到外界因素（包括細(xì)菌或病毒感染、炎癥細(xì)胞因子、TNF、LPS、紫外線照射、電離輻射）等刺激時(shí)，IκBα將發(fā)生磷酸化并迅速降解，NF-κB就被釋放、激活并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控一系列的基因表達(dá)。其中，NF-κB在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要的抗凋亡作用，因此，抑制腫瘤細(xì)胞NF-κB的活性將引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。有研究表明[17]，As2O3可強(qiáng)烈抑制HTLV-1和HTLV-2（human T-cell leukemia virus type1,2）細(xì)胞的IκBα磷酸化，使NF-κB不能進(jìn)入細(xì)胞核中，即抑制了NF-κBN的活化。啟動(dòng)子為NF-κB依賴性的抗凋亡蛋白Bcl-X1的表達(dá)也因此而下調(diào)?！鳓譵下降及Cyto-C的釋放導(dǎo)致caspase-3激活，進(jìn)而誘導(dǎo)了HTLV-1和HTLV-2這兩種對(duì)大多數(shù)凋亡誘導(dǎo)劑有抵抗作用的細(xì)胞發(fā)生凋亡。可見(jiàn)，抑制NF-κB的活性也是砷劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

2.6　使胞質(zhì)Ca2＋濃度升高

Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)以As2O3處理胃癌細(xì)胞系MGC803時(shí)，胞質(zhì)Ca2＋濃度升高與MGC803細(xì)胞凋亡呈平行關(guān)系，且兩者對(duì)As2O3呈時(shí)間、劑量依賴性。推測(cè)砷可能通過(guò)以下機(jī)制改變胞質(zhì)Ca2＋濃度：

（1）由于膜表面的Bcl-2相關(guān)蛋白具有陽(yáng)離子選擇性通道的功能，Bcl-2能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核和線粒體水平影響Ca2＋的亞細(xì)胞分布。因而，砷等凋亡信號(hào)對(duì)Bcl-2的抑制作用使Ca2＋通道開(kāi)放，胞質(zhì)Ca2＋濃度升高；

（2）細(xì)胞內(nèi)ROS活性升高及砷劑直接作用于細(xì)胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)位酶的巰基均可使胞內(nèi)外Ca2＋平衡失控；（3）線粒體△ψm下降使得Ca2＋吸收逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致Ca2＋由線粒體轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體內(nèi)Ca2＋耗竭可直接或通過(guò)加強(qiáng)線粒體內(nèi)氧化應(yīng)激而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而且，鈣離子本身作為一種凋亡信號(hào)，可調(diào)節(jié)鈣離子敏感的關(guān)鍵酶如蛋白激酶、磷脂酶、核酸內(nèi)切酶及谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶等誘導(dǎo)凋亡。

細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，探討砷劑對(duì)腫瘤的誘導(dǎo)凋亡作用很有意義，將為砷劑應(yīng)用于臨床提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]Shen ZX,Chen GQ,Ni JH,et al.Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia(APL):Ⅱ.clinical efficacyand pharmacokinetics in relapsed patients[J].Blood,1997，89:3354－3360.

[2]Soignet SL,Maslak P,Wang ZG,et al.Complete remission after treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic trioxide[J].New EnglJ Med,1998,339(19):1341－1348.

[3]Akao Y,Nakagawa Y,Akiyama K.Arsenic trioxide induces apoptosisin neuroblastoma cell lines through the activation of caspase3in vitro[J].FEBS Lett,1999,455(1～2):59－62.

[4]Look AT.Arsenic and apoptosis in the treatment of acute promyelocytic leukemia[J].J Natl Cancer Inst,1998，90(2):86－88.

[5]Wang ZG,Rivi R,Delva L,et al.Arsenic trioxide and melarsoprol in duce programmed cell death in myeloid leukemia cell lines and function in a Pmland PMLRARα independent manner[J].Blood,1998，92:1497－1504

.

[6]王劍明，鄒倩，鄒聲泉.Bcl2基因在阻塞性黃疸大鼠肝組織細(xì)胞凋亡中作用的研究[J].世界華人消化雜志，1999，7（12）:1035－1037.

[7]喬慶，吳金生，張靜，等.凋亡相關(guān)基因bcl2,bax在人類(lèi)大腸腺癌中的表達(dá)意義[J].世界華人消化雜志，1999，7（11）:936－938.

[8]李雪莉，郝遠(yuǎn)瑞，鄒建湘，等.Cmyc,Bcl2與胃癌生物學(xué)行為和細(xì)胞凋亡[J].新消化病雜志，1997，5（12）:773－774.

[9]郭琳瑯，曹長(zhǎng)安，王友順，等.Bcl2及相關(guān)蛋白bax在肝臟良惡性病變中的表達(dá)[J].新消化病雜志，1997，5（10）:655－656.

[10]Konig A,Wrazkl Z,Warrell RP,et al.Comparative activity of melarsoprol and arsenic trioxide in chronic Bcell leukemia lines[J].Blood,1997,90:562－570.

[11]Chen GQ,Zhu J,Shi XG,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia:As2O3induces NB4cell apoptosis with downregulation of Bcl2expression and modulation of PMLRAR alpha/Pmlproteins[J].Blood,1996，88(3):1052－1061.

[12]劉鐵夫，梁桃.三氧化二砷影響肝癌細(xì)胞系Hep201凋亡的研究[J].黑龍江醫(yī)學(xué)，2001，25（2）：81－82.

[13]劉琳，秦叔逵，陳惠英，等.三氧化二砷選擇性誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華肝臟病雜志，2000，8（6）：367－369.

[14]陳惠英，劉文虎，秦叔逵.三氧化二砷對(duì)肝癌細(xì)胞株凋亡的誘導(dǎo)作用[J].世界華人消化雜志，2000，8（5）：532－535.

[15]徐洪雨，高媛媛，武俏麗，等.三氧化二砷抑制人肝癌細(xì)胞株增殖和誘導(dǎo)凋亡作用[J].世界華人消化雜志，2000，8（11）：1233－1237.

[16]劉冰熔.核轉(zhuǎn)錄因子NFκB——腫瘤基因治療的新焦點(diǎn)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊(cè)，2001，24（3）：129－132.

[17]Mahieux R,PiseMasison C,Gessain A,et al.Arsenic trioxide induces apoptosis in human Tcell leukemia virus type1and type2infected cells by a caspase3dependent mechanism involving Bcl2cleavage[J].Blood,2001，98(13):3762－3769.

[18]Zhang TC,Cao HE,Li JF,et al.Induction of apoptosis and inhibition of human gastric cancermgC803cell growth by arsenic trioxide[J].Eur J Cancer,1999，35(8):1258－1263.