《生物化學(xué)與分子生物學(xué)》 (一)DNA的半保留復(fù)制(semiconservative replication)

Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時即推測，DNA在復(fù)制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。

1958年Meselson和Stahl利用氮標(biāo)記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留復(fù)制，他們將大腸桿菌放在含有15N標(biāo)記的NH4Cl培養(yǎng)基中繁殖了15代，使所有的大腸桿菌DNA被15N所標(biāo)記，可以得到15N桪NA。然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含有14N標(biāo)記的NH4Cl培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)不同代數(shù)時，收集細(xì)菌，裂介細(xì)胞，用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法觀察DNA所處的位置。由于15N桪NA的密度比普通DNA(14N－DNA)的密度大，在氯化銫密度梯度離心(density gradientcentrifugation)時，兩種密度不同的DNA分布在不同的區(qū)帶。

實驗結(jié)果表明：在全部由15N標(biāo)記的培養(yǎng)基中得到的15N桪NA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。當(dāng)轉(zhuǎn)入14N標(biāo)記的培養(yǎng)基中繁殖后第一代，得到了一條中密度帶，這是15N桪NA和14N-DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個區(qū)帶，這表明它們分別為15N14N－DNA和14N14N-DNA。隨著以后在14N培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強(qiáng)，而中密度帶逐漸減弱，離心結(jié)束后，從管底到管口，CsCl溶液密度分布從高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在與其相當(dāng)?shù)腃sCl密度處，在紫外光下可以看到DNA分子形成的區(qū)帶。為了證實第一代雜交分子確實是一半15N-DNA－半14N－DNA，將這種雜交分子經(jīng)加熱變性，對于變性前后的DNA分別進(jìn)行CsCl密度梯度離心，結(jié)果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶(15N－DNA)及低密度帶(14N－DNA)。它們的實驗只有用半保留復(fù)制的理論才能得到圓滿的解釋(圖16－2和16-3)。

圖16-2　DNA的半保留復(fù)制第一代分子含有一條親代的鏈(用黑色素示)，與另一條新合成的鏈(用白色表示)配對。在以后的連續(xù)復(fù)制過程中，原來親代的兩條鏈仍然保持完整，因此總有兩個分子各具有一條原來親代的鏈。圖16-3　DNA的半保留復(fù)制－MeslsonStahl實驗密度梯度離心后的DNA位置：左三管為對照；右三管為實驗結(jié)果