《臨床生物化學(xué)》 二、比色法與分光亮度法

在20世紀上半個世紀華勃儀得到研究實驗室廣泛的應(yīng)用，并在酶學(xué)上得到豐碩的成果。但此法操作煩瑣，技術(shù)要求高而且靈敏度低。臨床常規(guī)中很少使用。多使用簡單易行的比色法測酶活性。在上半個世紀建立了一些適用于常規(guī)工作的測酶活性濃度的方法，如測定淀粉酶的Somogyi法，堿性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。這些方法都是在酶和底物作用一段時間后停止酶反應(yīng)，加入各種化學(xué)試劑與產(chǎn)物或基質(zhì)反應(yīng)呈色，用比色計在可見光處比色，同時將被測物質(zhì)作標準管或標準曲線，比較后計算出在此段時間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物消耗量，從而求得反應(yīng)速率v。

比色法從50年代起逐步被分光光度法所取代。這是因為分光光度法有以下幾個顯著優(yōu)點：一是測定范圍不只局限在可見光，還可擴展到紫外和紅外部分。這就為擴大測定酶范圍提供了可能性。二是提供了尋找一類不需停止酶反應(yīng)就可直接測定產(chǎn)物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反應(yīng)A－＞B＋C，A、B、C三種物質(zhì)用分光光度法的吸收光譜如圖17-1所示。

圖17-1　A、B、C三種物質(zhì)的吸收曲線

可以看到C在560nm處有一吸收峰，而A和B在此處無吸光度變化因此無需停止酶反應(yīng)，只要在560nm處測定吸光度變化就很容易計算出C的變化速度，而且C物質(zhì)比A、B二物質(zhì)有更高的吸收峰，即靈敏度最高。

這類方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光譜差異建立的測酶活性濃度方法。NAD（P）H在340nm處有一吸收峰，而NAD（P）在此波段卻毫無吸光性。因此建立了一類和原來比色法截然不同方法。不需停止酶反應(yīng)，在340nm根據(jù)吸光度變化，就可觀察到酶反應(yīng)變化全過程。

第三個優(yōu)點是不需要如比色法那樣，作標準管或標準曲線，因為分光光度計使用近似單色光的光源，在此條件下，某一特定物質(zhì)的吸光度為常數(shù)，即人們所熟悉的摩爾吸光度（molar absorbance）。根據(jù)此值從吸光度△A/△T不難計算出酶催化反應(yīng)速度v。

分光光度計的這些簡便、準確等特點使它在近年來已逐步取代比色法而成為目前最流行的方法。其缺點是需要精確帶恒溫裝置的分光光度計，在經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)尚難推廣。

分光光度法的技術(shù)多樣化。設(shè)計得當(dāng)可用于各種酶的測定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化還原物質(zhì)特性。

除了前述的NAD(P)H系統(tǒng)可用于脫氫酶測定外，可利用黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）來測定各種含這二個輔基的酶。它們的氧化型在450nm有一很強吸收峰，而還原型的吸光度很低，同樣細胞色素還原型在可見光有一個非常明顯和很窄的吸收峰，都使人們很容易用分光光度法研究這些酶的作用。上述物質(zhì)主要用于氧化還原酶的測定。

科學(xué)家還設(shè)計出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法測定。例如合成了很多對硝基酚的衍生物，用于各種水解酶的測定。堿性磷酸酶底物磷酸對硝基酚就是一個成功例子。又如測芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸對硝基酚為底物，其分解產(chǎn)物的吸收峰由原來的278nm變?yōu)?18nm，Webb成功地在330nm進行此酶監(jiān)測。

表17-2　一些氧化還原物質(zhì)的特性

物質(zhì)波長（nm）克分子吸光度還原型氧化型NAD，NADP3406300FMN45012200FAD45011300細胞色素C550295008300亞甲藍（等消光點）61041000二氫酚吲哚酚60021000吩嗪甲酯硫酸388150022000抗壞血酸26515100連二亞硫酸鹽3148000氰化鐵（亞鐵）4201020

分光光度法的上述原理還可以用于其它酶的測定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不飽和鍵，在330nm處有很強吸收峰，而酶作用產(chǎn)物無此不飽和鍵。則不難在330nm處對這些酶進行直接測定。

此后在分光光度法的發(fā)展過程中又導(dǎo)入了酶偶聯(lián)技術(shù)。使得分光光度法幾乎能測定所有的酶。因此臨床實驗室工作者如不能很好掌握分光光度法的技術(shù)，不了解各種影響因素，要作好酶的測定是很困難的。