《臨床生物化學(xué)》 三、熒光法和同位素法

分光亮度法有一個(gè)缺點(diǎn)，即靈敏度較低。有些標(biāo)本中酶濃度很低時(shí)往往測(cè)不出來(lái)。此時(shí)可考慮改用熒光法，可將測(cè)定靈敏度提高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。如科學(xué)家合成了一系列甲基傘形酮的衍生物，可取代對(duì)硝基酚衍生物做為一些水解酶的底物，由于水解產(chǎn)物甲基傘形酮有強(qiáng)烈熒光，大大提高測(cè)定的靈敏度，就是分光亮度法中最常用的NAD(P)H反應(yīng)系統(tǒng)，也可改用熒光法，在340nm紫外線激發(fā)下NAD(P)H產(chǎn)生強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，而NAD(P)不被激發(fā)。此外，還可使用在熒光法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的時(shí)間分辨熒光法，例如北京醫(yī)院就曾利用此種靈敏度極高方法測(cè)定很難用其它方法檢測(cè)的腦脊液中微量的烯醇化酶。熒光法不易掌握，對(duì)所用的試劑、容器和儀器都要求很高，否則易產(chǎn)生非特異熒光干擾測(cè)定，或者引起熒光的淬滅使測(cè)定不準(zhǔn)，故此種方法多用于研究實(shí)驗(yàn)室，少用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。為提高靈敏度，還可使用同位素標(biāo)記的底物進(jìn)行酶測(cè)定，例如，有人以C12標(biāo)記的乙酰膽堿為底物測(cè)定膽堿酯酶，在酶作用后以離子交換法分離出含C14的乙酸。同位素方法由于對(duì)人體有害，操作麻煩，目前已很少使用。