《臨床生物化學(xué)》 三、分析性超速離心

與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測(cè)手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場(chǎng)中的沉降過(guò)程。

（一）分析性超速離心的工作原理

分析性超速離心機(jī)主要由一個(gè)橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學(xué)系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過(guò)一個(gè)柔性的軸聯(lián)接成一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置，此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時(shí)形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個(gè)冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納二個(gè)小室：分析室和配衡室。配衡室是一個(gè)經(jīng)過(guò)精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中，其工作原理與一個(gè)普遍水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下二個(gè)平面的石英窗，離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個(gè)離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過(guò)對(duì)紫外光的吸收（如對(duì)蛋白質(zhì)和DNA）或折謝率的不同對(duì)沉降物進(jìn)行監(jiān)視。后一方法的原理是：當(dāng)光線通過(guò)一個(gè)具有不同密度區(qū)的透明液，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。在分析室中物質(zhì)沉降時(shí)重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測(cè)系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一“峰”。由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。圖16-5是分析性超速離心系統(tǒng)的示意圖。

（二）分析性超速離心的應(yīng)用

⒈測(cè)定生物大分子的相對(duì)分子重量測(cè)定相對(duì)分子重量主要有三種方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應(yīng)用最廣的是沉降速度，超速離心在高速中進(jìn)行，這個(gè)速度使得任意分布的粒子通過(guò)溶劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動(dòng)，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個(gè)明顯的界面，該界面隨時(shí)間的移動(dòng)而移動(dòng)，這就是粒子沉降速度的一個(gè)指標(biāo)，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。

分子或粒子的相對(duì)分子重量則可從Svedberg方程式來(lái)確定：

圖16-5　分析性超速離心系統(tǒng)圖示

式中M：該分子不含水的相對(duì)分子重量；R：氣體常數(shù)；T：絕對(duì)溫度；S：分子的沉降系數(shù)；ν：分子的微分比容（當(dāng)一克溶質(zhì)加到一個(gè)大體積的溶液中所占有的體積）；ρ：溶劑的密度。

⒉生物大分子的純度估計(jì)靜分析性超速離心已廣泛地應(yīng)用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。用沉降速度的技術(shù)來(lái)分析沉降界面是測(cè)定制劑均質(zhì)性的最常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認(rèn)為是均質(zhì)的，如有雜質(zhì)則在主峰的一側(cè)或二側(cè)出現(xiàn)小峰。

⒊分析生物大分子中的構(gòu)象變化分析性超速離心已成功地用于檢測(cè)大分子構(gòu)象的變化，例如DNA可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質(zhì)上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的，如果遇到某種因素（溫度或有機(jī)溶劑）DNA分子可能發(fā)生一些構(gòu)象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構(gòu)象上的變化可以通過(guò)檢查樣品在沉降速度上的差異來(lái)證實(shí)。