《基因診斷與性傳播疾病》 第八節(jié)　診斷

HSV感染的診斷要依據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果而定。有不潔性交史，而且在生殖器部位出現(xiàn)皮膚紅斑和原發(fā)性水皰，易復(fù)發(fā)等不難診斷。必要時(shí)可作皰液涂片，培養(yǎng)、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測(cè)定等，均有助于診斷和確定病毒類(lèi)型。

一、細(xì)胞學(xué)方法

對(duì)皮損刮片做Wright-Gemsa （Tzanck試驗(yàn)）或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特征的巨細(xì)胞包函體，但不能區(qū)別HSV感染或水痘— 帶狀皰疹病毒感染，敏感性?xún)H為病毒分離的60%。

二、培養(yǎng)法

從水皰底部取材做組織培養(yǎng)分離病毒，為目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術(shù)條件要求高，價(jià)格昂貴，不能普遍使用。

三、抗體檢測(cè)

目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測(cè)，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測(cè)HSV-2抗體，具有敏感性，且能區(qū)分HSV-1和HSV-2的優(yōu)點(diǎn)。

四、基因診斷

（一）用PCR分型檢測(cè)單純皰疹病毒

PCR是一種敏感性高，特異性強(qiáng)的快速檢測(cè)方法，標(biāo)本中含有1fg HSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發(fā)展較快，且分型檢測(cè)HSV是發(fā)展的趨勢(shì)。

1、標(biāo)本采集和處理

（1）標(biāo)本采集

①腦脊液：直接無(wú)菌采取患者0.5ml腦脊液標(biāo)本于無(wú)菌試管送檢.如肉眼可見(jiàn)血色,應(yīng)離心取上清。

②羊水及嬰兒血清: 同上,應(yīng)避免溶血.

③腦組織: 腦組織尸檢、活檢標(biāo)本,加1ml PBS標(biāo)本緩沖液研磨后，待檢。

④眼及皮膚病灶分泌物：用預(yù)測(cè)（半干）棉拭子直接取患處分泌物，置1ml PBS標(biāo)本緩沖液中送檢。

⑤生殖器（宮頸、陰道、外陰、陰莖）標(biāo)本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預(yù)潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1ml PBS標(biāo)本緩沖液中送檢。

（2）標(biāo)本處理

①預(yù)處理：所有液體標(biāo)本均可直接進(jìn)行模板制備；可以取100μl標(biāo)本液，離心5000r/ min×5min后，去上清，取沉淀物進(jìn)行模板制備。

②模板制備：a: 蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h后，煮沸10 min，離心5000 r/ min×5min，收集上清。 b:水煮法：沉淀物加100μl蒸餾水，搖均水煮20 min，離心5000 r/ min×5min收集上清。c:1%Triton　X-100裂解法:取采集的標(biāo)本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d: 5%NP-40裂解法：取采集的標(biāo)本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000r/ min×5min收集上清。e:如標(biāo)本溶血嚴(yán)重經(jīng)上述裂解處理后，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μlDW溶解待檢。

2、PCR擴(kuò)增

（1）引物設(shè)計(jì)。以HSV DNA聚合酶的高保守區(qū)為檢測(cè)靶序列以確保特異性。設(shè)計(jì)3個(gè)引物，一個(gè)上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二個(gè)下游特異性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′?。┖虳NAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分別擴(kuò)增出HSV-1469bpDNA片段（1981～2359）、HSV-2 391bp片段（1561～1953）：從二型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中設(shè)計(jì)了一個(gè)不分型的特異性探針HSVP3 5‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘）。

（2）PCR實(shí)驗(yàn)體系。取模板10μl： DNAP5　0.5（0.2μmol/L）：DNAP3-10.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2　0.5μl (0.2μmol/L)：4×dNTP 8μl(4×200μmol/L)：10×dNTp 8μl(4×200μmol/L)；10×緩沖液10μl：DMSO 4μl；加DW65.5μl；石蠟油 30μl.。

水煮（96℃～100℃）7min加TaqDNA聚合酶1μl；（2.5U）72℃4 min
↓
95℃40s
↓ 65℃60s　→72℃70s
↓33個(gè)循環(huán)
70℃4 min

3．?dāng)U增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析

（1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加樣品緩沖液4μl混勻后，點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠（EB）染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果在溴酚藍(lán)后面有一條或二條亮紅帶為陽(yáng)性結(jié)果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無(wú)帶則為陰性結(jié)果。

（2）XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產(chǎn)物50μl加X(jué)hoI50U，37℃1h后，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產(chǎn)生46bp片段帶（引物后面）；與正常PCR產(chǎn)物比較，XhoI酶切后的大片段電泳位置前移。

（3）Southern印跡法：PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2 h，42℃預(yù)雜交（雜交液中）30min，加入32p標(biāo)記HSVP3探針后,42℃雜交過(guò)夜；次日用1%SDS/ PBs pH7.2,　42℃洗15min， 0.5%SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15min; 膜置X線(xiàn)暗盒內(nèi)放射性自顯影12～15h,顯影為陽(yáng)性, 不顯影為陰性。

（二）套式PCR

套式PCR（nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR）是通過(guò)“外側(cè)”、“內(nèi)側(cè)”兩對(duì)引物，即一對(duì)擴(kuò)增較大DNA片段的“外側(cè)”引物和一對(duì)位于擴(kuò)增產(chǎn)物中再擴(kuò)增小片段的“內(nèi)側(cè)”引物，這樣兩次連續(xù)放大可以提高PCR檢測(cè)的靈敏度，保證產(chǎn)物的特異性。但該方法不能分型，能100%檢出HSV-1，50%檢出HSV-2，應(yīng)改進(jìn)分型檢測(cè)HSV，更好地在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究中推廣應(yīng)用。

1、　標(biāo)本處理：

（1）標(biāo)本采集同上

（2）DNA 制備：①腦脊液：取100μlCSF 水煮15min,加入250μl無(wú)水乙醇，放-30℃10min；離心10000g30 min，去上清，30℃干燥后，加入10μl DW； ②腦組織細(xì)胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10min；取上清加入等體積酚一氯仿（V/V），輕搖10 min，離心10000r/min×10min;取水相，加入250μl DW溶解。

2、PCR擴(kuò)增

(1)引物設(shè)計(jì)：選擇HSV1糖蛋白D基因?yàn)闄z測(cè)靶基因。

NP-PCR 的引物和探針序列

“外”引物BJHSV1.1ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA19-43BJHGV1.2CATACCGGAACGCACCACACAA218-239“內(nèi)引物”BJHSV1.3CCATACCGACCACACCGACGA51-79BJHSV1.4CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA166-188探針BJHSV-1PROTACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT96-125

(2) PCR實(shí)驗(yàn)體系和程序:　反應(yīng)體積為50μl；模板10μl；BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L)； BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L)； 10×緩沖液5μl； 4×dNTp 4μl(4×200mmol/L)；DW 27μl; 石蠟油30μl。循環(huán)參數(shù)為95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循環(huán)20次, 取其擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應(yīng)體系中進(jìn)行套式擴(kuò)增,先95℃變性2min，循環(huán)參數(shù)為95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循環(huán)30次后，72℃延伸5min;。

(3) 擴(kuò)增產(chǎn)物分析：

①　瓊脂糖凝膠電泳染色法：

取擴(kuò)增產(chǎn)物10μl點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中， 70V電泳15-20min,溴化乙錠染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果,在溴酚蘭后面有一條，或二條亮紅條帶為陽(yáng)性結(jié)果,HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無(wú)帶則為陰性結(jié)果。

② Southern印跡法：

PCR產(chǎn)物20μl 經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，80℃烤膜2h，42℃預(yù)雜交（雜交液中）30min，加入32P標(biāo)記HSV探針后，42℃雜交過(guò)夜，次日用1%SDS/PBs pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min；膜置X線(xiàn)暗盒內(nèi)，放射性自顯影12-15h，，顯影為陽(yáng)性，不顯影為陰性。

（三）、聚合酶鏈反應(yīng)—酶譜法（polymerase chain reaction-endonucleasecleavage PCR-EC）

具有經(jīng)濟(jì)廣泛等特點(diǎn)；不僅能一次性分型檢測(cè)HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四種病毒，而且方法本身快速、方便、無(wú)放射線(xiàn)損傷，易被實(shí)驗(yàn)室接受?？蓹z出3個(gè)CFU的HSV1，靈敏度高，能檢測(cè)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染第1dCSF中HSv DNA陽(yáng)性結(jié)果，并可用于藥物治療效果的評(píng)價(jià)。由于病毒的變異性，會(huì)出現(xiàn)酶切點(diǎn)突變丟失現(xiàn)象，從而造成酶切陰性結(jié)果。對(duì)此可以通過(guò)型特異性探針或序列分析解決。

1. 標(biāo)本處理

（1）　 標(biāo)本采集，方法同上。

（2）　 DNA模板制備：每份標(biāo)本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h；

加入等體積的酚—氯仿（v/v）輕搖10min，離心1000r/min×5min；取水相加入500μl(2.5倍體積)無(wú)水乙醇，-20℃過(guò)夜沉淀DNA，離心15000r/min×5min,吸去液體，30℃干燥后,加蒸餾水25μl溶解,待檢。

2. 引物設(shè)計(jì)：

P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

（1）PCR實(shí)驗(yàn)體系：

反應(yīng)體積100μl； 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ，P20.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×緩沖液10μl, DMSD 5μl, Dw 65μl, 循環(huán)參數(shù)為94℃60s;60℃60s; 72℃60s；循環(huán)40次72℃延伸4min。

（2）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)與酶切分型.

①第一步電泳鑒定: 取10μlPCR產(chǎn)物加4μl樣品緩沖液,加入2%瓊脂糖凝膠板,70V電泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外燈下觀察,可初步鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

②酶切分析：分別取20μlPCR產(chǎn)物于2個(gè)Eppendorf管中，加入50μl無(wú)水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分別用20μlSmal和BamHI反應(yīng)緩沖液溶解，加入SmaI或BamHi50U于相應(yīng)Eppendorf 管內(nèi)，37℃作用1h。

③第二步電泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩沖液，加到2%瓊脂糖凝膠中,70V電泳,15-20min后,EB染色5min,與同步加入未酶切的PCR產(chǎn)物相對(duì)照。 紫外燈下觀察,結(jié)果如下:

PCR-EC法檢測(cè)四種病毒結(jié)果

病毒型號(hào)靶片段SmaIBamHIHSV1518bp476bp+42bpHSV2518bp—225+293bpEBV524bp100bp+424bp277bp+247bpCMV589bp不需酶切,第一步電泳就可以區(qū)分

（四）用RT-PCR檢測(cè)單純皰疹病毒

RNA的聚合酶鏈反應(yīng)（RNA-PCR），可能通過(guò)檢測(cè)HSV不同期的RNA，這不僅可診斷HSV感染，而且有利于HSV的潛伏期感染機(jī)制的深入研究。

RT-PCR是以RNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以達(dá)到檢測(cè)目的。因此，RNA-PCR也可稱(chēng)為RT-PCR。

1、標(biāo)本處理：

組織塊細(xì)胞總RNA提取，取100mg組織標(biāo)本，加1ml硫氰酸胍變性液，于勻漿器中，室溫研磨均勻后，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻,用力振搖10s, 置冰浴15min。10000g4℃,離心20min,取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質(zhì))加入等體積異丙醇置-20℃1h,沉淀RNA。離心 15000r/min×10min,棄上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解,再加0.3ml異丙醇沉淀,-20℃1h, 沉淀RNA. 離心15000r/min×10min,去上清, 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次, 真空干燥。.加10μl TE緩沖液（pH7.4）溶解,低溫保存?zhèn)溆?臨用前冰浴溶解。

2、PCR擴(kuò)增:

（1） 引物設(shè)計(jì): 選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測(cè)靶基因.設(shè)計(jì)2個(gè)引物，

P1　 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′

P2　 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以擴(kuò)增ICPO 中266bp序列。

1個(gè)探針：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

（2）PCR實(shí)驗(yàn)體系：總反應(yīng)體積為50μl，模板10μl （0.25-1.0μg）P1　1μl (20pmol/L)；P2 1μl (20pmol/L);4×dNTP 4μl（200μmol/L)； 10×緩沖液5μl； AMV(逆轉(zhuǎn)錄酶)2μl(50U)； DW 26μl； 循環(huán)參數(shù), 94℃變性2min后 94℃50s，60℃60,72℃60s，循環(huán)40次后72℃延伸5min。

3、擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：

（1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加4μl 樣品緩沖液，混勻后加樣2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15-20min，EB染色5min。紫外燈下觀察擴(kuò)增條帶。

（2）Southern印跡雜交法：用32P標(biāo)記的特異性探針檢測(cè)PCR產(chǎn)物，方法同上。

總之，在HSV感染性疾病的臨床診斷中，PCR能對(duì)前病毒或潛伏期低復(fù)制的HSV特異性靶DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，遠(yuǎn)較DNA探針敏感，并能在血清中抗體出現(xiàn)前就可以檢出。因此，PCR無(wú)論是作為基礎(chǔ)研究手段，還是作為臨床檢驗(yàn)診斷方法，均具有廣闊的前景。

五、病理組織學(xué)診斷

細(xì)胞內(nèi)水腫，基底層形成大水皰，病灶周?chē)卸嗪司藜?xì)胞浸潤(rùn)，特別是多核白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞充斥于病灶中間。