《基因診斷與性傳播疾病》 第七節(jié)　實(shí)驗(yàn)室檢查

一、醋酸白試驗(yàn)

用3-5%醋酸外涂疣體2-5分鐘，病灶部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鐘。本試驗(yàn)的原理是蛋白質(zhì)與酸凝固變白的結(jié)果，HPV感染細(xì)胞產(chǎn)生的角蛋白與正常的未感染上皮細(xì)胞產(chǎn)生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗(yàn)檢測(cè)HPV的敏感性很高，它比常規(guī)檢測(cè)觀察組織學(xué)變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陽(yáng)性變白跡象顯得界限不清和不規(guī)則。美國(guó)CDC提示，醋酸白試驗(yàn)并不是特異試驗(yàn)，且假陽(yáng)性較常見。

二、免疫組織學(xué)檢查

常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法（即PAP），顯示濕疣內(nèi)的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽(yáng)性時(shí)，尖銳濕疣的淺表上皮細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)淡紅色的弱陽(yáng)性反應(yīng)。

三、組織化學(xué)檢查

取少量病損組織制成涂片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結(jié)合。在過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成紅色。此法特異性強(qiáng)且較迅速，對(duì)診斷有幫助。

四、病理檢查

主要為角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長(zhǎng)，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細(xì)胞和基底細(xì)胞并有相當(dāng)數(shù)量的核分裂、頗似癌變。但細(xì)胞排列規(guī)則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點(diǎn)為粒層和刺層上部細(xì)胞有明顯的空泡形成。此種空泡細(xì)胞較正常大，胞漿著色淡、中央有大而圓，深嗜堿性的核。通常真皮水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張以及周圍較致密的慢性炎性浸潤(rùn)。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣，表皮極度向下生長(zhǎng)，代替了其下面的組織、易與鱗狀細(xì)胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發(fā)展之傾向，則為一種低度惡變的過程，即所謂疣狀癌。

五、基因診斷

迄今，HPV難于用傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)，主要實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)是核酸雜交。近年來(lái)發(fā)展的PCR方法具有特異、敏感、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，為HPV檢測(cè)開辟了新途徑。

（一）標(biāo)本的采集及處理

1．標(biāo)本的采集和預(yù)處理：用刮板或生理鹽水浸潤(rùn)的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細(xì)胞。在作細(xì)胞學(xué)檢查的同時(shí)，將標(biāo)本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心（3000g，10min）洗滌2次，沉積細(xì)胞重懸于1mlPBS中，取0.5ml細(xì)胞懸液抽提DNA。

2．標(biāo)本核酸的提取：按1體積細(xì)胞懸液加10倍體積的細(xì)胞裂解液（10mmol/l Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿(1:1)，氯仿/異戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10體積3mol/l NaAc（pH5.2）及2.5倍體積無(wú)水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉淀DNA；加1體積乙醇洗滌1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/l Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA)溶解DNA，37℃溫育30min。

（二）PCR擴(kuò)增

1．引物設(shè)計(jì)和合成：HPV基因組可分為早期區(qū)（E）和晚期區(qū)（L），每區(qū)含一系列開放讀碼框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非編碼區(qū)及E1、E6、E7和L1區(qū)均有保守序列。Manos等從HPVL1區(qū)中選擇保守序列設(shè)計(jì)合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPv 6、11、16、18及33型有互補(bǔ)序列，也可擴(kuò)增其它型HPV。

Manos等設(shè)計(jì)的HPVL1通用引物

MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG

MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC

表1

HPV型MY11的第1個(gè)鹼基位置MY09的第1個(gè)鹼基位置PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度（bp）6672271704481167077155448166584703545118655870124543365396987448

M=A+C， R=A+G，W=A+T，Y= C+T

表2列述了Manos等設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針。公用混合探針序列選自HPVL1區(qū)中另一保守序列，可與　MY11和MY09引物產(chǎn)生的多種HPVL1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交：型特異探針只與相應(yīng)HPV型有互補(bǔ)序列，用于檢出的HPV分型。

表2　 Manos等設(shè)計(jì)的HPVL1PCR產(chǎn)物探針

公用混合探針GP1　CTGTTGTTGATACTACACGCAGTACGP2 CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC第一個(gè)鹼基位置HPV6　6771 HPV11　6757 HPV16　 6631HPV18 6607 HPV33　6588型特異探針探針HPV型序列基因位置MY12HPV6CATCCGTAACTACATCTTCCA6813—6833MY13HPV11TCTGTGTCTAAATCTGCTACA6800—6820MY14HPV16CATACACCTCCAGCACCTAA6926—6945MY74HPV18GGATGCTGCACCGGTCTGA6905—6922MY16HPV33CACACAAGTAACTAGCTACAG6628—6648

H=A+C+T，R=A+G，W=A+T，Y=C+T

2．PCR反應(yīng)試劑：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/l dNTP貯備液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR緩沖液(500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5)，100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。

3．PCR擴(kuò)增方法和程序：以100μlPCR反應(yīng)液,用無(wú)菌0.5ml硅化塑料離心管為反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

（1）實(shí)驗(yàn)前配制預(yù)混反應(yīng)試劑并分裝。預(yù)混反應(yīng)試劑包括除標(biāo)本DNA外的其它各種PCR反應(yīng)試劑。每支反應(yīng)管中含有的PCR反應(yīng)試劑見表3。

表3每支反應(yīng)管中的PCR反應(yīng)試劑

反應(yīng)試劑體積（μl）終濃度10×PCR緩沖液101×PCR緩沖液dNTP貯備液2200μmol/L每種dNTPMY11貯備液0.5500μmol/LMY09貯備液0.5500μmol/LTaq DNA聚合酶0.52.5μ滅菌蒸餾水75.5總計(jì)90.0

（2）各反應(yīng)管依次加入10μl標(biāo)本和90μl預(yù)混反應(yīng)試劑。

（3）加入80-100μl石蠟油，在臺(tái)式離心機(jī)上快速離心數(shù)秒鐘，使各反應(yīng)試劑收集于油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應(yīng)體積為25μl。使用時(shí)只加入標(biāo)本DNA即可。

（4）將反應(yīng)管置PCR擴(kuò)增儀上，循環(huán)參數(shù)為95℃30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環(huán)35次，最后72℃延伸5min。

4．每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照。以載有HPV的重組質(zhì)粒（每反應(yīng)為100pg）或含有HPV的細(xì)胞系（如Caski、HeLa）DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)HPV的人細(xì)胞系DNA為陰性對(duì)照。

（三）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析

1．凝膠電泳：擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，冷卻至室溫，取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結(jié)果，分子量約為450bp處出現(xiàn)明顯的DNA帶。

2．核酸雜交：如果凝膠電泳無(wú)清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時(shí)，可用標(biāo)記的公用混合探針和（或）型特異探針作Southern吸印雜交、斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證。

按照標(biāo)準(zhǔn)方法制32p ATP標(biāo)記的寡核苷酸探針，需達(dá)到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振蕩下雜交2-3h，隨后于30-55℃下用洗滌液（2×SSC、0.1%SDS）迅速?zèng)_洗雜交膜，除去多余探針。然后進(jìn)行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10min，并換液重洗1次；MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。

用PCR方法檢測(cè)HPV比核酸雜交方法優(yōu)越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結(jié)果，可檢出標(biāo)本中200個(gè)拷貝的HPv DNA，若以核酸雜交檢測(cè)PCR產(chǎn)物，敏感性提高，能檢出10個(gè)拷貝的HPv DNA。

鑒于PCR技術(shù)的高度敏感性，以生殖道脫落細(xì)胞為檢材足以滿足試驗(yàn)要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，觀察產(chǎn)生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術(shù)檢測(cè)HPV實(shí)驗(yàn)周期短、簡(jiǎn)便快速。