《基因診斷與性傳播疾病》 第一節(jié)　衣原體感染癥（chlamydia trachomatis）

沙眼衣原體是（chlamydia trachomatis，CT）是一種在人體內(nèi)長(zhǎng)期生存并又廣泛傳播的病原體，屬條件致病菌。它在一定條件下能引起子宮頸感染、早產(chǎn)、流產(chǎn)及尿道感染等多種疾病，尤其是在與淋球菌等其他病原體合并感染時(shí)更加重疾病的發(fā)展及引起其它并發(fā)癥，在無(wú)癥狀子宮頸和男、女性泌尿系統(tǒng)常有沙眼衣原體的存在，其檢出率不一。至今，西方國(guó)家已有10-20%的人口感染有沙眼衣原體，特別是性接觸而傳播其感染率更高，成為目前醫(yī)學(xué)所關(guān)注的重大問(wèn)題之一。最近，在對(duì)我國(guó)大陸性亂人群進(jìn)行檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)多的人其泌尿生殖系統(tǒng)感染有CT，并已構(gòu)成我國(guó)性傳播疾?。⊿TDs）。

一、病原學(xué)

衣原體是一類能通過(guò)細(xì)胞濾器，有獨(dú)特發(fā)育周期、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物。具有以下特點(diǎn)(1)具有DNA和RNA兩種類型的核酸；(2)二分裂方式繁殖，發(fā)育周期特別；(3)細(xì)胞壁成份中含有肽聚糖；(4)含有核蛋白體；(5)對(duì)多種抗生素都敏感。衣原體廣泛寄生于人類，哺乳動(dòng)物及鳥(niǎo)類，僅少數(shù)有致病性。只有沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體可以引起人類疾病。

目前已知衣原體有15種血清型。A、B、Ba、C血清型主要引起眼疾患，D-K型引起生殖器疾患，L-1-L3型為引起性病淋巴性肉芽腫的病原體。它們嚴(yán)格稱細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，大小約300-400μm，在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，有特殊的發(fā)育周期，感染力為基本小體，增殖力為網(wǎng)狀體，在電鏡下可見(jiàn)胞膜呈有絲分裂繁殖。

衣原體對(duì)熱敏感，56℃-60℃僅能存活5-10分鐘，在-70℃可保存數(shù)年。0.1%甲醛液、0.5%石碳酸可將衣原體在短期內(nèi)殺死，75%乙醇?xì)缌軓?qiáng)，半分鐘即有效，對(duì)利福平、四環(huán)素、紅霉素均敏感。

二、流行病學(xué)

近年來(lái)各種報(bào)道顯示，淋菌性尿道炎發(fā)病率下降，而非淋菌性尿道炎卻不斷上升，居STDs的首位。其中CT感染所致的病例顯著增加，如美國(guó)報(bào)道非淋菌性尿道炎約半數(shù)為CT所致，在淋病中有20-40%從病灶中分離出CT，另?yè)?jù)報(bào)道男性非淋菌性尿道炎在世界急劇上升，以美國(guó)為例、一年間就300萬(wàn)人患本癥。女性宮頸炎等，在女性生殖器感染癥中CT也是其主要的病原菌。

男性非淋菌性尿道炎最常見(jiàn)的病原菌是沙眼衣原體。在美國(guó)異性戀男性中沙眼衣原體陽(yáng)性率達(dá)40%，每年約有60萬(wàn)男性患者呈持續(xù)性或復(fù)發(fā)性NGU，同時(shí)發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體宮頸炎婦女其男性性伴侶的感染率為42%，患衣原體尿道炎的男性其女性性伴侶的感染率為62%，無(wú)癥狀的沙眼衣原體感染在性活躍的男人間傳播率更高。

引起男性不孕癥的因素很多，但最近發(fā)現(xiàn)從無(wú)生殖力的膿性精液及男子性腺活檢標(biāo)本中分離出沙眼衣原體，進(jìn)一步提示和證明了沙眼衣原體引起男性不孕癥的可能性。有人對(duì)淋病感染癥的男性患者進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有高效價(jià)的抗衣原體抗體，衣原體陰性淋菌尿道炎者亦有高價(jià)抗衣原體抗體，并發(fā)現(xiàn)65-85%的非淋菌性后尿道炎是由沙眼衣原體引起。

附睪炎是男性NGU最主要的并發(fā)癥，在年輕的性活躍的男性附睪炎患者中，45-60%是由沙眼衣原體引起。大多數(shù)病人有尿道癥狀或體征，尿道標(biāo)本和附睪吸取液中可分離到衣原體。

沙眼衣原體性子宮頸炎在女性衣原體感染中最多。因?yàn)楦腥局话l(fā)生于子宮頸的柱狀上皮，而不感染陰道的鱗狀上皮，故不造成陰道炎。英國(guó)去性病門診就醫(yī)的婦女衣原體培養(yǎng)陽(yáng)性率為20-30%，微量免疫熒光法檢測(cè)血清抗體達(dá)60%。淋病患者的宮頸炎標(biāo)本衣原體陽(yáng)性率為30-35%，伴不典型宮頸炎或無(wú)癥狀衣原體宮頸感染為3-5%，說(shuō)明衣原體隱性感染率和混和型感染率相當(dāng)高，對(duì)宮內(nèi)避孕器的應(yīng)用者進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)由避孕器引起的盆腔炎癥中大部分是由衣原體感染所致。在男性NGU患者配偶的宮頸中有30-60%分離出衣原體。在與感染的

■［此處缺少一些內(nèi)容］■

性亂及正常家庭中，沙眼衣原體的泌尿生殖道感染率在5-25%之間，特別是家庭成員之間的傳播更應(yīng)引起重視，不少兒童性NGU是由沙眼衣原體的感染引起的。

三、傳播途徑

男性非淋菌性尿道炎約30-70%可通過(guò)性交傳染給女性，反之亦有25-50%患有衣原體性宮頸炎的女性經(jīng)性交亦可傳給男性。新生兒由母體垂直感染，發(fā)生衣原體性結(jié)膜炎，有10-20%發(fā)生肺炎，女性感染CT還有由宮頸炎上升而并發(fā)腹腔內(nèi)諸器宮感染。由于“口交”亦能引起口腔內(nèi)衣原體感染。另外，由宮頸、輸卵管處分離出CT的事實(shí)，也可說(shuō)明其傳播途徑。

應(yīng)該說(shuō)明一點(diǎn)：當(dāng)今有些所謂NGU與性行為并無(wú)關(guān)系，如醫(yī)源性感染（尿道插管、膀胱鏡以及外傷或化學(xué)性刺激等）。還有所謂NGU并非是由衣原體性微生物所致，在含義上應(yīng)該與NGU加以區(qū)別，因?yàn)椴≡w不同，而傳播途徑也有所不同，故醫(yī)生在診治中要心中有數(shù)。

四、發(fā)病機(jī)理與免疫

衣原體感染人體后，首先侵入柱狀上皮細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，然后進(jìn)入單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)增殖。由于衣原體在細(xì)胞內(nèi)繁殖，導(dǎo)致感染細(xì)胞死亡，同時(shí)尚能逃避宿主免疫防御功能，得到間歇性保護(hù)。衣原體的致病機(jī)理是抑制被感染細(xì)胞代謝，溶解破壞細(xì)胞并導(dǎo)致溶解酶釋放，代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒作用，引起變態(tài)反應(yīng)和自身免疫。

當(dāng)人體感染衣原體后，產(chǎn)生特異性的免疫，但是這種免疫力較弱，持續(xù)時(shí)間短暫，因此，衣原體感染容易造成持續(xù)，反復(fù)感染，以及隱性感染。細(xì)胞免疫方面，大部分活動(dòng)性已治愈的衣原體患者，給予相應(yīng)的抗原皮內(nèi)注射時(shí)，常引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。這種變態(tài)反應(yīng)可用淋巴細(xì)胞進(jìn)行被動(dòng)轉(zhuǎn)移。此種免疫性很可能是T細(xì)胞所介導(dǎo)。體液免疫方面，在衣原體感染后，在血清和局部分泌物中出現(xiàn)中和抗體。中和抗體可以阻止衣原體對(duì)宿主細(xì)胞的吸附，也能通過(guò)調(diào)理作用增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的攝入。

五、臨床表現(xiàn)

（一）男性衣原體性尿道炎（chlamydia urethritis，CU）

又稱為非淋菌性尿道炎（NGU）。是由衣原體感染引起的非急性化膿性尿道粘膜炎性病變。目前已成為STDs中最常見(jiàn)的一種。

本病潛伏期比淋病長(zhǎng)，約1-3周或數(shù)月，主要表現(xiàn)為尿道內(nèi)不適，刺痛及燒灼感，并伴有不同程度的尿頻、尿急、尿痛，尿痛較淋病為輕。尿道口輕度紅腫并有漿液或粘液膿性分泌物，稀薄而量少，長(zhǎng)時(shí)期不排尿或早晨首次排尿前可見(jiàn)尿道口分泌物污染內(nèi)褲，并可見(jiàn)尿道口有“糊口”現(xiàn)象；分泌物少時(shí)，于晨起擠壓尿道才流出少量粘液。合并膀胱炎時(shí)可有血尿；無(wú)癥狀性非淋菌性尿道炎，約30-40%病人癥狀不典型或根本無(wú)癥狀。約1/3左右的淋球菌尿道炎病人合并沙眼衣原體感染，淋病治愈后又出現(xiàn)尿道炎癥狀，易誤診為慢性淋病或PPNG菌株感染。

沙眼衣原體感染易并發(fā)附睪炎，表現(xiàn)為附睪腫大，變硬及觸痛，多為單側(cè)，部分患者的抗沙眼衣原體抗體升高，可直接從附睪抽吸液中分離出沙眼衣原體；累及睪丸可出現(xiàn)睪丸炎，表現(xiàn)為睪丸疼痛、觸痛、陰囊水腫及輸精管變硬變粗；累及前列腺時(shí)可出現(xiàn)后尿道、會(huì)陰及肛門部位鈍痛或觸痛，可有性功能障礙，直腸鏡檢可觸及有壓痛的前列腺。如前列腺明顯腫大，可壓迫后尿道而出現(xiàn)尿流變細(xì)、排尿無(wú)力及尿流中斷等；本病還可以合并Reiter綜合征，即關(guān)節(jié)炎，結(jié)膜炎，尿道炎三聯(lián)癥。

（二）女性生殖系統(tǒng)衣原體感染癥

女性感染衣原體不限于尿道，可累及整個(gè)泌尿生殖器官，此類感染常因缺乏自覺(jué)癥狀或癥狀輕微而忽視了治療，造成傳染源而擴(kuò)散，形成危害。

女性衣原體感染比男性感染引起的癥侯要多，其主要感染部位為宮頸，由此垂直感染給新生兒，以至發(fā)生PID等，其后遺癥多導(dǎo)致不孕癥。

無(wú)癥狀感染（缺乏癥狀反應(yīng)）：由于本病缺乏自覺(jué)癥狀，則局部病象便成為診斷的一個(gè)重要指標(biāo)，表現(xiàn)為陰道有膿樣分泌物，亦可為粘液或漿液性。分泌物量較多（為中等量），稍有臭味。陰道粘膜為正常顏色，但常伴有宮頸糜爛。

衣原體性宮頸炎：當(dāng)伴發(fā)宮頸炎時(shí)、宮頸發(fā)紅，有漿液或膿性分泌物增加、陰道內(nèi)糜爛擴(kuò)大，易于出血等癥狀。鏡檢下陰道分泌物的所謂“陰道清潔度”多為III度以上。沙眼衣原體主要侵犯宮頸的柱狀上皮細(xì)胞，而磷狀上皮細(xì)胞常不被侵犯，故陰道，宮頸局部沒(méi)有改變。

宮頸炎的主要癥狀是白帶增多，不時(shí)出血及小腹部疼痛等一般癥狀，無(wú)特異性表現(xiàn)，多因其性伴患有尿道炎而來(lái)院就診。

衣原體性輸卵管炎，本癥多由宮頸炎并發(fā)引起。用腹腔鏡直接從輸卵管抽吸物標(biāo)本中，約30%以上檢測(cè)出衣原體，病情經(jīng)過(guò)多數(shù)較輕、下腹部可有輕微疼痛，一般體溫不高，但血沉稍快。由于這種非典型經(jīng)過(guò)，使病人拖延就醫(yī)，往往引起子宮附件損害，形成輸卵管炎的后遺癥，其最主要表現(xiàn)是輸卵管性不孕癥。

盆腔炎（PID）：PID不是固定疾患的用語(yǔ)，凡在盆腔內(nèi)感染癥，如宮內(nèi)感染，輸卵管炎等附件炎癥波及盆腔腹膜特定的部位感染均可稱之為PID，由CT引起的PID主要是由宮頸炎上行感染所致。其主要表現(xiàn)是急腹癥型。

部分患者可導(dǎo)致宮外孕、流產(chǎn)、不孕、死胎及新生兒死亡。有些病人除不孕外，可無(wú)任何癥狀。也可通過(guò)產(chǎn)道傳染，引起嬰兒眼結(jié)膜炎、鼻炎、中耳炎、肺炎及陰道炎等。

六、診斷與鑒別診斷

診斷衣原體性疾患，目前在我國(guó)尚未普及，因此，往往漏診，所以應(yīng)當(dāng)重視臨床表現(xiàn)，爭(zhēng)取做到化驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)求得確診。

患者來(lái)就醫(yī)時(shí)，男性主訴常常是尿道疼，不適感或從外尿道流出膿樣粘液，或因患“淋病”久治不愈，反復(fù)出現(xiàn)上述現(xiàn)象；女性病人常常無(wú)癥狀，只是白帶多或因其丈夫有“淋病”史，特意來(lái)檢查確診。

（一）臨床癥狀

首先應(yīng)排除淋菌性尿道炎

衣原體性尿道炎與淋菌性尿道炎鑒別

臨床病癥沙眼衣原體淋球菌潛伏期1-3周2-5日發(fā)病緩慢突然尿路刺激征輕或無(wú)多見(jiàn)全身癥狀無(wú)偶見(jiàn)尿道分泌物少或無(wú)，粘液性或漿液性稀薄常見(jiàn)，量多呈膿性無(wú)癥狀帶菌者相當(dāng)多有，但不多白細(xì)胞內(nèi)G-雙球菌（一）（+）病原菌培養(yǎng)沙眼衣原體淋球菌

（二）實(shí)驗(yàn)室診斷

檢測(cè)出病原體或病原體特異性DNA是診斷本病唯一標(biāo)準(zhǔn)，近年來(lái)由于對(duì)CT直接分離培養(yǎng)成功，加之基因診斷技術(shù)在CT診斷方面的成功應(yīng)用，使過(guò)去認(rèn)為難以診斷的疾患已提高到最易診斷的一種疾患，但是上述兩項(xiàng)技術(shù)特殊，對(duì)操作人員及實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求嚴(yán)格，在一般醫(yī)院實(shí)行起來(lái)尚難完成。一般只用CT抗原法進(jìn)行診斷。

1．衣原體細(xì)胞培養(yǎng)：對(duì)沙眼衣原體敏感的細(xì)胞株為McCoy細(xì)胞、Hela-229細(xì)胞和BHK細(xì)胞，最常用的是經(jīng)放線菌酮處理的單層McCoy細(xì)胞，孵育后，用單克隆熒光抗體染色，可迅速診斷，但操作人員一定要熟練，需專業(yè)培養(yǎng)。培養(yǎng)法的敏感性為80%-90%，陽(yáng)性即可確立診斷。

2．衣原體細(xì)胞學(xué)檢查法：在感染細(xì)胞內(nèi)可有衣原體的包涵體存在。從感染部位采取細(xì)胞標(biāo)本作涂片，姬姆薩染色包涵體是藍(lán)色或暗紫色，碘染色顯示褐色。但敏感性差（40%），目前已較少采用。

近年來(lái)采用熒光素標(biāo)記的抗衣原體單克隆抗體，來(lái)檢測(cè)細(xì)胞涂片中的衣原體，使用較為方便，目前主要用衣原體外膜蛋白（MOMP）的單克隆抗體的商品試劑（Mico Trak，Pathfinder，Monofluor）。結(jié)果判斷：要衣原體數(shù)>10個(gè)才能判為陽(yáng)性。

3．PCR檢測(cè)衣原體DNA：

（1）標(biāo)本的處理：

①取材部位為子宮頸管，男性為尿道，將滅菌白金耳深入宮頸管或尿道1cm左右，轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)圈，停留約30s，取出后置標(biāo)本緩沖液中。

② 衣原體DNA提?。?/p>

將宮頸管內(nèi)或尿道內(nèi)刮取物置含0.5% NP-40、0.5%Tween 20，1% SDS和2mg/ml 蛋白酶K的TES緩沖液（50mmol/L Tris-HCl，50mmol/l NaCl，100mmol/L EDTA，pH 8.0）置37℃裂解60min，沸水5min，酚、氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，沉淀物溶于20μlTE緩沖液(100mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。

（2）引物設(shè)計(jì)：

引物對(duì)選自衣原體16SrRNA基因，為衣原體屬特異性，以DNA合成儀固相亞磷酸三酯合成并純化。引物對(duì)的序列分別為5′GTGGATAGTCTCAACCCTAt 3′(16SrRNA基因位點(diǎn)832-851)和5′TATCTGTCCTTGCGGAAAAC3′(位點(diǎn)1041-1022)。目的擴(kuò)增片段（832-1041）長(zhǎng)210bp。

（3）PCR擴(kuò)增：

傳統(tǒng)的方法反應(yīng)體積為100μl，含5x反應(yīng)緩沖液20μl和FD-DNA聚合酶2U、4種dNTP各200μmol/L以及引物對(duì)各25pmol/L。上述成分預(yù)先一次性分裝于0.5ml離心管，-20℃?zhèn)溆谩ＥR用加模板DNa 2μl，短暫離心，加100μl礦物油覆蓋?，F(xiàn)在試劑已商品化，反應(yīng)體積為25μl，單管已分裝好，只要加入模板DNA即可。置DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行40次循環(huán)擴(kuò)增。每次循環(huán)包括90℃變性45s(第一次循環(huán)變性2min)，55℃退火30s和72℃延伸40s（最后一次循環(huán)72℃，延伸5min）三個(gè)步驟。每次擴(kuò)增均應(yīng)作陰陽(yáng)性對(duì)照。

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

① 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：取10u l PCR擴(kuò)增物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳、0.5μg/ml溴化乙錠染色，以PGEM-3Zf（+）DNA-Hae Ⅲ為分子量標(biāo)準(zhǔn)，置紫外透射儀觀察結(jié)果。

② 生物素寡核苷酸探針的檢測(cè)

a.探針序列及合成：探針序列為5′ACTCAA-AAGAATTGACGGGGGCCCGCACAa3′(30mer)，衣原體16Sr RNA基因中的位點(diǎn)為909-938，與PCR擴(kuò)增片段中間序列互補(bǔ)。以DNA合成儀固相亞磷酸三酯法合成并純化。

b.標(biāo)記：按Riely等方法略有修改。以末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）催化Bio-11-dUTP標(biāo)記到合成的寡核苷酸探針片段3′-OH端。反應(yīng)體系含：140mmol/L二甲胂酸鈉，30mmol/l Tris-HCl（pH 7.6），100μmol/L Bio-11-dUTP，0.1μmol/L 寡核苷酸片段，0.05%BSA，300U/mlTdT。于37℃保溫3h后，加10mmol/LEDTA終止。寡核苷酸片段探針標(biāo)記后，將標(biāo)記探針（1ng/μl）作2倍系列稀釋，取5μl點(diǎn)膜,封閉后顯色。結(jié)果探針經(jīng)32倍稀釋（最高稀釋度5ng）后仍呈現(xiàn)明顯的顯色反應(yīng)，證實(shí)探針的標(biāo)記以及顯色效應(yīng)良好。

c.DNA斑點(diǎn)雜交：提取的DNA或其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物0.5mol/l NaOH變性20min，取5μl點(diǎn)于硝酸纖維素膜，烘干；以6×SSC(1xSSC為：0.15mol/l NaCl，0.015mol/L檸檬酸三鈉，pH 7.0)浸泡2次，80℃干烤2h。置6×SSC，5×Denhardt液，0.2%SDS，50μg/ml變性牛胸腺DNA，10mmol/l EDTA中于55℃雜交3h后，加入終濃度為150μg/ml的探針，于55℃雜交過(guò)夜。以2×SSC-0.1%SDS室溫漂洗3次，每次15min。

d.顯色：將雜交漂洗后的濾膜浸泡于0.1mol/l Tris-HCl (pH7.5)，0.15mo l/L NaCl，0.05%Tween20，0.05%%TritonX-100，2%BSA中，37℃封閉6min；置4μg/ml親和素的緩沖液A（0.1mol/l Tris-HCl，0.15mol/LNaCl，pH 7.5）中，37℃孵育30min，緩沖液A漂洗3次；再置于含1μg/ml生物素化堿性磷酸酶的緩沖液A中，37℃作用30min，緩沖液A漂洗2次，緩沖液B（0.1mol/lTris-HCl，0.1 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2，pH 9.5）漂洗2次。最后將膜泡于含0.1mg/ml磷酸萘酚AS-MX和0.6mg/ml堅(jiān)固藍(lán)RR的緩沖液B中，暗處顯色30min。

PCR擴(kuò)增衣原體DNA有十分高的特異性及敏感性，結(jié)合生物素標(biāo)記的衣原體寡核苷酸探針作DNA斑點(diǎn)雜交。可作為衣原體診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其敏感度可以檢測(cè)相當(dāng)于1個(gè)拷貝的衣原體DNA分子。

七、治療

衣原體對(duì)作用于細(xì)胞壁的藥物耐藥，如青霉素類、萬(wàn)古霉素、桿菌肽，對(duì)于抑制膜蛋白和胞漿蛋白合成藥物敏感，如四環(huán)素、紅霉素等。

治療方案

首先四環(huán)素類，四環(huán)素500mg每日4次，連服7天，或用強(qiáng)力霉素100mg每日2次，連服7日。對(duì)四環(huán)素禁用或耐受性差的患者，可改服紅霉素500mg，每日4次，連服7日，復(fù)方新諾明亦有效。

另外近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的對(duì)各領(lǐng)域的感染癥廣泛使用的新藥喹諾酮類，在治療衣原體方面臨床效果較好，其中常用的藥物有氧氟沙星（OFIX），環(huán)丙沙星（CPFX），洛美沙星，利福平治療效果也較好。

治療中應(yīng)注意的問(wèn)題：

（1）四環(huán)素類藥物對(duì)妊娠婦女有致畸作用，故應(yīng)禁用。

（2）從目前臨床觀察來(lái)看用喹諾酮類藥物比應(yīng)用四環(huán)素類藥物為好，因?yàn)榛颊叨鄶?shù)有淋球菌或其它合并感染。

（3）治療時(shí)間2-3周為宜。衣原體繁殖周期為48-72小時(shí)，寄生在細(xì)胞內(nèi)，藥物滲入細(xì)胞內(nèi)的濃度一般較低。所以治療時(shí)間需要長(zhǎng)些。

（4）在男女感染后無(wú)癥狀或癥狀輕微者，可視為帶菌者，應(yīng)接受正規(guī)治療。對(duì)患者的性伴要同時(shí)治療。

（5）聯(lián)合用藥：四環(huán)素類+喹諾酮類

紅霉素類+喹諾酮類

四環(huán)素類+利福平

喹諾酮類+利福平