《動脈粥樣硬化》 四、含重組質(zhì)粒的細(xì)胞菌落的鑒定

含重組質(zhì)粒的細(xì)胞菌落常用的鑒定方法有：①小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析；②α互補(bǔ)；③插入失活；④雜交篩選。下面簡要介紹小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶切分析。小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA可用天美等公司的Wizard Minipreps DNA試劑盒或采用下述方法：

1.挑取一些獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)，用無菌牙簽或挑種環(huán)挑取單菌落于2ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。

2．將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30s，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。

3．吸取培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。

4．將細(xì)菌沉淀重懸于200μl溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。

溶液Ⅰ 25mmol/L Tris·HCl（pH8.0）

10mmol/LEDTA（pH8.0）

溶液Ⅰ可成批配制，每瓶約100ml，高壓下101bf/m2（6.895×104pa）蒸氣滅菌15min，貯存于4℃。

5．加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH

1% SDS

蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。

6．加200μl溶液Ⅲ

溶液Ⅲ 5mol/l 乙酸甲 60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

蓋緊管口，將管倒置，溫和振蕩10min，使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3～5min。

7．用微量離心管于4℃以12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移另一離心管中。

8．加等量酚和氯仿，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心2min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

9．用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合，于室溫放置2min。

10．用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心5min。

11．小心吸去上清液，將離管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。

12．用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟1所述方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀，干燥10min。

13．用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μl/ml）的TE重新溶解核酸，振蕩，貯存于-20℃。

14．用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶分析所得DNA。