《動(dòng)脈粥樣硬化》 五、M13噬菌體重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌

1．感受態(tài)細(xì)胞的制備

（1）將1ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌（如DH52、TG1、TM101）接種于100ml2×YT培養(yǎng)于500ml燒瓶。于37℃刷烈振蕩，通?！?00rpm培養(yǎng)的細(xì)菌密度約OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。

（2）將培養(yǎng)物放于冰上致冷10min，于4℃離心細(xì)菌培養(yǎng)物，10000rpm離心10min。

（3）棄除上清，將細(xì)菌懸浮于原始培養(yǎng)體積的一半（約50ml）的50mMCaCl2和10mmTris·HCl（pH8.0）無菌冷凍液體中。

（4）將細(xì)菌懸浮放在冰上約5min，然后將懸浮物于4℃10000/rpm離心10min。

（5）棄上清，懸浮細(xì)菌于原始培養(yǎng)體積的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl（pH8.0）無菌冷凍中。此時(shí)的細(xì)胞是感受態(tài)細(xì)胞，即可用于轉(zhuǎn)化。200μl分裝于無菌的1.5ml微量離心管中，貯存于-80℃冰箱中。

2．轉(zhuǎn)化程序

（1）取出200μl感受態(tài)細(xì)胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或連接反應(yīng)混合物，DNA量通?！?0mg。用手指彈打試管10次，使之混勻，然后放在冰上40～45min。

（2）將管放于42℃水浴中2min。

（3）然后每管直接加入1.0ml2×YT培養(yǎng)基，倒置混勻，并于37℃培養(yǎng)8～12h，干浴或水浴，不需振搖。此期間使細(xì)菌生長并開始表達(dá)抗菌素。

（4）每200μl轉(zhuǎn)化混合物分別于6個(gè)2×YT瓊脂培養(yǎng)板上補(bǔ)充相應(yīng)抗生素，并含有X-gal（20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。

（5）鋪板使細(xì)菌混合物干后，倒轉(zhuǎn)平板放于30～37℃培養(yǎng)箱中18～22h?？寺≡诖似陂g應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。