《動(dòng)脈粥樣硬化》 二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法多以Mendel和Higa（1970）的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化。

用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌。本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，且迅速、重復(fù)性好。操作過程簡(jiǎn)述如下。

1．從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h（旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min），每隔20～30min測(cè)量OD600值≈0.4。

2．在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。

3．于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭（或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。

4．倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

5．以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上。

6．于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭（或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。

7．倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。

8．每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

9．用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。

10．將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動(dòng)試管。

11．快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2min。

12．每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。

13．將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/l MgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上。

14．將平板置于室溫至液體被吸收。

15．倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落。