《動脈粥樣硬化》 一、質(zhì)粒或噬菌體載體與外源DNA的連接反應(yīng)

外源DNA片段末端的性質(zhì)，以及質(zhì)粒載體和外源DNA上限制酶切位點的性質(zhì)決定了質(zhì)?；蚴删w與外源DNA連接反應(yīng)的不同策略。

（一）外源DNA帶有非互補突出端的片段

用兩種不同的限制酶分別消化質(zhì)粒等載體和外源DNA，可以產(chǎn)生帶非互補突出端的片段，這是最容易連接的片段，如圖24-1所示。

將已經(jīng)連接外源DNA的細(xì)菌質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌，然后在含有AP等抗生素的平板上鑒定陽性重組體菌落，具體方法有：①檢查α互補能力的喪失情況；②對小量制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切的分析；③核酸雜交。

（二）外源DNA帶有相同末端（平端或粘端）的片段

帶有相同末端（平端或粘端）的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質(zhì)粒或噬菌體載體中，在連接反應(yīng)中，質(zhì)?；蚴删w載體可能發(fā)生自身環(huán)化，也可能形成串聯(lián)寡聚物。因而，常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制質(zhì)粒DNA的自身連接和環(huán)化。用細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）或牛小腸堿性磷酸酶（CIP）去除線狀DNA兩端的5’磷酸可以最大限度地減少質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。而具有5’末端磷酸的外源DNA片段可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA相連接，產(chǎn)生一個含有兩個切口的開環(huán)分子。因為環(huán)化DNA（即使只帶切口的環(huán)狀DNA）的轉(zhuǎn)化效率比線狀DNA高得多，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)化體都含有重組質(zhì)粒，如圖24-2所示。

圖24-2 利用磷酸酶防止載體DNA的重新環(huán)化

（三）外源DNA帶有平端的片段

外源DNA片段帶有平端的片段，平端的連接效率比帶有互補末端的DNA要低得多。因此，涉及平端分子的連接反應(yīng)所要求的T4噬菌體DNA連接酶的濃度和外源及質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA的濃度都要高得多。

（四）連接反應(yīng)的體系

10×連接緩沖液1μl

10mMATp 1μl

質(zhì)?；蚴删wDNa200ng～1μg

外源DNa 200ng～1μg

T4噬菌DNA連接酶0.5～2nuits

4-6℃溫育8～24h

連接反應(yīng)結(jié)束時，取1～5μl上述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化200μl的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即可將外源DNA與載體接連起來。