《動脈粥樣硬化》 第二節(jié)　動脈粥樣硬化動物模型

一、常用動脈粥樣硬化動物模型的比較

動脈粥樣硬化模型所用的動物有鼠、兔、豬、狗、猴，依上述理想動物模型的要求最常用的是兔、豬和鼠。各種動物誘導方法和形成特征的差異，見表22-1。

表22-1 動脈粥樣硬化模型的種類

動物種類疾病誘導方法特征鴿自然發(fā)生，或高脂飲食鼠高脂膳食高脂血癥，肥胖大白兔高脂膳食高脂血癥，肥胖血栓性血管壁損害纖維增厚，粥樣硬化新西蘭兔非剝離性內(nèi)皮損害細胞纖維內(nèi)膜增厚進行性病變，內(nèi)膜增厚豬高脂膳食，壁損害極似人類病變狗高脂膳食猴高脂膳食好發(fā)冠狀動脈硬化

二、動脈粥樣硬化動物模型制作過程

主要介紹豬和兔兩種動物模型的制作過程。因其容易獲得、價格便宜、操作簡單，常為首選動物。

1．豬的動物模型

健康雄性中國小型豬，按統(tǒng)計學需要，自定數(shù)量。5～6月齡，稱其體重并記錄，隨機分為實驗組和對照組，每組數(shù)量相等，單籠飼養(yǎng)，對照組只給基礎飼料，實驗組基礎飼料每只動物按25g·kg-1/d分兩次給予，上午在少量基礎飼料中拌入10%蛋黃粉和1.2%膽固醇，待吃完后再添足飼料。每月根據(jù)體重變化情況調(diào)整飼料量。兩組均自由攝水。為使動脈粥樣硬化模型更接近人的病變，可采用間接飼養(yǎng)法，于第17周停喂膽固醇和蛋黃粉4周，到第21周再恢復，并不再調(diào)整飼料量，直至第29周。

2．兔的動物模型

兔可選日本大白兔或新西蘭白兔（常用作內(nèi)膜剝脫造型）。8周齡或成年兔，稱其體重記錄，隨機分組，單籠飼養(yǎng)。每日給膽固醇1.5g，上午以少量基礎飼料拌食，待吃完后，再添足基礎飼料（每日每只120g），對照組則只供基礎飼料，兩組均自由攝水，飼養(yǎng)10周。

以上均為高脂膳食法，此外還有一種較常見的造型法是剝脫內(nèi)膜法，其操作是選用我國的大耳白兔，每天只給0.5g膽固醇和大油1.5g，蛋黃5g，1周后經(jīng)右股淺動脈，將3.5F球囊擴張導管插至腹主動脈20cm，球囊充液膨脹至2個大氣壓緩慢拉出，反復3次。

三、相關(guān)指標檢測

動脈粥樣硬化的模型檢測，大體包括病理形態(tài)學檢查，免疫組織化學檢查以及生化檢查三個方面。

1．病理形態(tài)學觀察

為了對比，豬在14～29周，兔在5～10周，處死兩組動物（每周各一只），作飼養(yǎng)過程的經(jīng)過觀察。

（1）肉眼觀察主動脈沿縱軸剪開，蘇丹Ⅲ、Ⅳ混合染色，投影格子計數(shù)法分別計算每條主動脈內(nèi)膜總面積，胸、腹主動脈內(nèi)膜面積以及蘇丹Ⅲ、Ⅳ染色陽性的脂質(zhì)條紋及隆起的纖維斑面積，求出各類病變面積百分比。冠狀動脈自心臟剝下，沿縱軸切開，蘇丹Ⅲ、Ⅳ混合液染色，按上述方法計算每條冠狀動脈內(nèi)膜及其病變面積，求出病變面積百分比。在實驗組（豬）14周時脂質(zhì)條紋面積和纖維斑面積的百分比分別是9.64%和1.56%左右。冠狀動脈在主支近端1/3處可見纖維斑。

（2）光鏡觀察從胸主動脈和冠狀動脈典型病變處分別取材，常規(guī)石蠟切片，厚4μm，HE染色。用目鏡測微尺于200倍鏡下測量動脈纖維斑或脂質(zhì)條紋的最大厚度及中膜厚度，求其厚度比值，兩組的值應有顯著的差異。Masson染色片，光鏡下400倍計數(shù)三個視野的腹主動脈和冠狀動脈左前降支纖維斑內(nèi)胞漿紅染的梭形細胞（視為平滑肌細胞）數(shù)。其值在兩組間亦應有顯著的差異。此外，尚可在實驗組見到內(nèi)膜缺損或裂隙。

（3）電鏡觀察動脈處死后迅速取材（部位同光鏡），2.5g戊二醛及1%鋨酸雙重固定，常規(guī)制備樣品，以超薄切片機切片，乙酸鈉，檸檬酸鋁染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡樣品經(jīng)逐級酒精脫水，臨界點干燥，鍍膜后觀察。在動物模型組應見到內(nèi)皮細胞變性壞死脫落，見到髓磷脂小體，細胞間連接變直變寬，內(nèi)皮下間隙擴大，有較多的平滑肌細胞（SMC）和泡沫細胞。泡沫細胞胞質(zhì)內(nèi)密集成群分布的大脂滴和膽固醇結(jié)晶，結(jié)晶使細胞核移位，胞體腫大，部分泡沫細胞崩解，如圖22-1所示。線粒體腫脹變性，多數(shù)SMC胞漿內(nèi)充滿大量細胞器（粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體等）。但肌絲成分較少，間質(zhì)可見彈力纖維增生，細胞外脂質(zhì)沉積。

圖22-1 猴大動脈硬化灶電鏡圖

喂飼一年形成的高膽固醇血癥猴的大動脈呈高度動脈粥樣硬化斑塊（fattystreak）表面，內(nèi)皮細胞呈復雜的凸凹不平。一部分細胞接合分離、巨噬細胞祼落、血小板粘著凝集。

2．免疫組化定性定位觀察

目前市場上有多種免疫組化所需的抗原抗體提供，針對LDL的動脈粥樣硬化斑可采用組化分析，用相應的LDL抗體為第一抗體的PAP法觀察LDL在動脈粥樣硬化病灶內(nèi)的分布。LDL免疫活性陽性的顆粒主要分布在泡沫細胞周邊，在纖維斑塊內(nèi)，LDL顆粒呈彌漫性分布，在病灶深部內(nèi)彈力板附近，有大量LDL顆粒聚集成帶狀。

3．生化指標檢測

在動物飼養(yǎng)全過程中，每周應進行一次血脂測定?？稍诙轨o脈取血或心臟直接抽血。常測指標有血清總膽固醇（TC），某油三酯（TG），低密度脂蛋白（LDL），高密度脂蛋白（HDL），載脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ），載脂蛋白B（ApoB）等，其動物模型，除ApoAⅠ和HDL外，其他各項指標與對照組比較出現(xiàn)不同程度的升高，尤其以TC、LDL、ApoB最為顯著。此外，血小板膜流動性（PMF）及丙二醛（MDA）也可用作參考指標。