《動(dòng)脈粥樣硬化》 第三節(jié)　單向免疫擴(kuò)散法

一、原理

將抗載脂蛋白血清均勻地混合于瓊脂糖凝膠內(nèi)，打孔，加樣?？字写郎y(cè)樣品的抗原輻射狀向含抗體的膠內(nèi)擴(kuò)散，至抗原與抗體的量達(dá)一定比例時(shí)形成可見的沉淀環(huán)。一定條件下沉淀環(huán)的直徑或面積與相應(yīng)的抗原Apo含量成正比。

二、試劑

1.0.05mol/L pH8.2巴比妥鈉-HCl緩沖液；巴比妥鈉15.8g加水至1000ml。以1.17mol/l HCl調(diào)pH至8.2，約1.17mol/L Hcl（濃HCl 19.3ml加水180.7ml）18.36ml，最后以蒸餾水補(bǔ)足至1421.8ml。

2．24.0g/L瓊脂糖：優(yōu)質(zhì)瓊脂糖粉2.4g，硫柳汞0.01g，加0.05mol/lpH8.2巴比妥鈉HCl緩沖液100ml，加熱融化后，根據(jù)澆注板的大小分裝，每管5.8ml、3.4ml、1.5ml，加塞后4℃或室溫保存。

3．0.1g/L硫柳汞生理鹽水：1000ml生理鹽水中含硫柳汞0.1g。

4．抗血清：臨用前根據(jù)澆注板的大小，按效價(jià)稀釋。

三、操作

1．澆注瓊脂糖凝膠板

取“凹”型有機(jī)玻璃框架，厚1.6mm，兩邊夾6×12cm玻璃，再用鐵夾夾緊玻璃待用。

加熱融化24.0g/L瓊脂糖，56℃水浴保溫。根據(jù)抗Apo血清效價(jià)，按表18-19進(jìn)行配制。

表18-19 含抗血清瓊脂糖板配制法

試　 劑抗　血　清　RID　法 效　價(jià)20253040608024.0g/L瓊脂(ml)5.805.805.805.805.805.80硫柳汞鹽水(ml)5.225.345.415.515.615.65抗血清(ml)0.580.460.390.290.190.15

將稀釋的抗血清傾入已融化的瓊脂糖中，顛倒混勻1～2次，避免產(chǎn)生氣泡，迅速澆注預(yù)置水平位置的雙層玻板內(nèi)，待凝。抗血清效價(jià)高時(shí)，亦可直接將抗血清混入12.0g/L瓊脂中，搖勻后制板。

2．按模式圖用直徑3mm的金屬管打孔，6×12cm免疫擴(kuò)散板打孔28個(gè)，6×8cm免疫擴(kuò)散板打孔16個(gè)。

3．待測(cè)血清用硫柳汞鹽水稀釋（按說明書），用微量加樣器每份標(biāo)本加1孔。加樣量10μl。置濕盒（水平位置）37℃擴(kuò)散24h，測(cè)沉淀環(huán)直徑，如圖18-2所示。

圖18-2　單向免疫擴(kuò)散圖（0.8％瓊脂糖）

4． 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備（參考方法）

（1）參考血清稀釋法：取Apo含量標(biāo)準(zhǔn)參考血清用鹽水稀釋成梯度濃度。ApoAⅠ：20、40、60、80、100mg/dl，同上法操作加樣，每一稀釋濃度應(yīng)在兩塊板的不同位置各加樣孔，每孔5μl。37℃濕盒擴(kuò)散24h，測(cè)沉淀環(huán)直徑，求出各稀釋度均值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）用半對(duì)數(shù)紙制作：以抗原含量為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)），沉淀環(huán)直徑為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上作圖。一般要求至少有4個(gè)不同稀釋度。增加標(biāo)準(zhǔn)曲線上的點(diǎn)數(shù)；可增加其可靠程度。

（3）用推算平均值法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：RID定量法盡管嚴(yán)格遵守所有的試驗(yàn)條件，但不同濃度所求得的沉淀環(huán)直徑，在繪制曲線時(shí)仍然常不在一條直線上，推算平均值法是通過數(shù)學(xué)方法處理，使不在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的各點(diǎn)回歸到同一直線上來?？捎霉絣og y=ax＋b表示。

結(jié)果判斷

根據(jù)待測(cè)血清在含抗Apo血清免疫擴(kuò)散板上形成的沉淀環(huán)直徑，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可行相應(yīng)Apo的含量?？梢詍g/dl報(bào)告，也可以國際單位報(bào)告（g/L）