《中國(guó)生物制品規(guī)程》 布氏菌素制造及檢定規(guī)程

本品系牛、羊、豬型布氏菌的30天肉湯培養(yǎng)物，經(jīng)加溫殺菌的除菌過(guò)濾液。對(duì)已有布氏菌感染或曾接受布氏菌活菌苗免疫之機(jī)體。能引起特異的皮膚變態(tài)反應(yīng)。供布氏菌病的診斷及檢測(cè)免疫反應(yīng)用。

1　菌種

1.1　制造布氏菌素所用牛、羊、獵型布氏菌菌種應(yīng)由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。

1.2　菌種用凍干法保存。同1批凍干菌種經(jīng)檢定合格后，保存于2～8℃，每次啟開(kāi)菌種時(shí)可只做菌型鑒別及變異檢查。凡在培養(yǎng)基上傳代保存者，每月必須做變異檢查。

1.3　菌種檢定

1.3.1　培養(yǎng)特性

各型布氏菌菌種之硫堇、堿性復(fù)紅染料抑制試驗(yàn)及硫化氫反應(yīng)應(yīng)具有型有典型特性。

1.3.2　變異檢查

用三勝黃素凝集及加熱沉淀反應(yīng)作變異檢查。如有變異則不可用于制造布氏菌素。

1.3.3　血清學(xué)檢查

用各型菌種的新鮮培養(yǎng)物分別與已知效價(jià)的布氏菌診斷血清作凝集反應(yīng)，其凝集價(jià)應(yīng)達(dá)到血清之原效價(jià)。

2　制造

2.1　制造布氏菌素至少要用牛、羊、獵型菌種各1株，分別在pH6.8～7.0的普通肉湯中培育。

2.2　各型菌種分別接種在肝瓊脂或其他適宜培養(yǎng)基上，于37℃培育44～48小時(shí)，經(jīng)檢查不含雜菌者，用滅菌生理鹽水將菌苔洗下制成菌液，接種各大瓶肉湯培養(yǎng)基中，每1000ml培養(yǎng)基約接種200億～500億菌體，放37℃培育30天，在培養(yǎng)期的最初5天，要每天用肉眼逐瓶檢查，凡有雜菌生長(zhǎng)者應(yīng)廢棄。

2.3　純菌試驗(yàn)

培養(yǎng)到期后，各瓶肉湯培養(yǎng)物分別抽樣按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》做純菌試驗(yàn)，凡有雜菌生長(zhǎng)者應(yīng)廢棄。

2.4　加溫殺菌

將純菌試驗(yàn)合格的每瓶肉湯培養(yǎng)物置水浴中，80℃加溫1小時(shí)殺菌。

2.5　無(wú)菌試驗(yàn)

加溫殺菌之各瓶培養(yǎng)物冷卻后逐漸抽樣按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》做無(wú)菌試驗(yàn)，不應(yīng)有布氏菌及雜菌生長(zhǎng)。

2.6　除菌過(guò)濾

取檢查合格的牛、羊及豬型肉湯培養(yǎng)物等量混合，然后除菌過(guò)濾作為1批。同批肉湯培養(yǎng)物同時(shí)濾入數(shù)瓶時(shí)按瓶分為亞批。

2.7　分裝

除菌過(guò)濾后，必須將濾液盡快分裝安瓿。封口后，將所有安瓿置37℃培育5日。長(zhǎng)菌溫濁及外觀不合格者廢棄。布氏菌素不加任何防腐劑。

2.8　制備對(duì)照液

用同批培養(yǎng)基但不接種布氏菌，于同樣條件下培養(yǎng)制成布氏菌素對(duì)照液，并分裝安瓿供檢定用。

3　成品檢定

3.1　物理檢查

布氏菌素為澄明的淡黃色液體，無(wú)沉淀，無(wú)異物。

3.2　無(wú)菌試驗(yàn)

每亞批菌素均應(yīng)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)。

3.3　毒性及安全試驗(yàn)

用弱毒菌生產(chǎn)時(shí)，每亞批菌素抽樣只做毒性試驗(yàn)。用體重18～20g小白鼠5只，每只皮下注射布氏菌素0.5ml。注射后3日內(nèi)全部小白鼠健存，毒性試驗(yàn)判為合格。凡有死亡者應(yīng)復(fù)試1次，如仍有死亡則該批菌素應(yīng)廢棄。如用毒菌生產(chǎn)，則半成品及成品均須做毒性及安全試驗(yàn)。將毒性試驗(yàn)全部活存之小白鼠，在注射后20日解剖，取鼠蹊部淋巴結(jié)，腹大動(dòng)脈旁之淋巴結(jié)及肝、脾分別接種肝瓊脂斜面上，放37℃培育5天。如無(wú)布氏菌生長(zhǎng)，安全試驗(yàn)即判為合格。

3.4　效力試驗(yàn)

用牛型104M菌株或其他弱毒布氏菌株約10億活菌，皮下注射體重250～300g豚鼠。豚鼠在免疫后2～6個(gè)月內(nèi)均可供作效價(jià)試驗(yàn)用，但每只豚鼠只可作1次試驗(yàn)。每批菌素用4只已免疫的豚鼠和2只健康豚鼠，背部脫毛后，分別在3處皮內(nèi)注射布氏菌素原液、10倍稀釋液及對(duì)照液各0.1ml。注射部門之間距至少3cm。注射后24及48小時(shí)觀察反應(yīng)，免疫豚鼠在注射布氏菌素原液處應(yīng)有明顯紅腫反應(yīng)，10倍稀釋液處可有微弱紅腫反應(yīng)，對(duì)照常液處應(yīng)無(wú)反應(yīng)。健康豚鼠各處均應(yīng)無(wú)反應(yīng)。

4　保存與效期

應(yīng)保存于2～8℃。自檢定合格之日起效期為2年。