《中國生物制品規(guī)程》 精制抗毒素制造及檢定規(guī)程

本規(guī)程適用于白喉、破傷風、氣性壞疽及肉毒四種精制抗毒素。

精制白喉、破傷風、氣性壞疽、肉毒抗毒素系分別由各該抗毒素的馬血漿經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干抗毒素球蛋白制劑。分別用于各該疾病的預(yù)防和治療。

1　制造

1.1對血漿的要求

1.1.1制造精制抗毒素的血漿，應(yīng)符合附錄1《抗毒素生產(chǎn)用馬匹免疫方法》的規(guī)定。在保存期間如發(fā)一周明顯的溶血、染菌及其他異?，F(xiàn)象，不得投入生產(chǎn)。

1.1.2血漿的抗毒素效價不得低于下列要求：

血漿種類每瓶血漿效價（IU/ml）

白喉1000

破傷風1000

威氏250

膿毒300

水腫550

溶組織550

A型肉毒1000

B型肉毒600

E型肉毒600

以上效價均以動物測定方法為準。

1.2制造程序

1.2.1消化

1.2.1.1第1法

血漿用2～4倍水稀釋，調(diào)節(jié)pH至3.2～3.6，加入胃酶適量及甲苯0.2%～0.4%（ml/ml），于29～31℃消化1～1.5小時。

1.2.1.2第2法

血漿用2～4倍水稀釋，調(diào)節(jié)pH至3.6～4.0，加入胃酶適量及甲苯0.2%～0.4%（ml/ml），于22±℃消化20～22小時。

1.2.2第1次沉淀及加熱處理。

每100ml消化液加硫酸銨14～16g，白喉及破傷風抗毒素調(diào)節(jié)pH至4.8～5.6，氣性壞疽及肉毒抗毒素調(diào)節(jié)pH至4.5～5.0；白喉、破傷風、氣性壞疽抗毒素加溫至57～57℃，肉毒抗毒素加溫至50～52℃，均保持30分鐘。加溫終了，盡速降溫至45℃以下，分離，取清液。

1.2.3第2次沉淀

上述清液調(diào)節(jié)pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸銨19～21g，分離，取沉淀，壓干。

上述沉淀用水稀釋至蛋白含量不超過2%（g/ml），加明礬不少于0.8%(g/ml)，調(diào)節(jié)pH至7.7～7.9，分離，取清液。

1.2.5濃縮

1.2.5.1第1法

將上述清液第100ml加硫酸銨38g，分離，取沉淀，壓干。沉淀物透析至硫酸銨含量0.1%（g/ml）以下。

1.2.5.2第2法

將上述清液混合，通過超濾裝置進行超濾，濃縮至硫酸銨含量為0.1%（g/ml）以下。

1.2.6最后處理

上述透析后的血清進行下列處理：

1.2.6.1調(diào)整固體總量不超過20%（g/ml）。蛋白含量不超過17%（g/ml）。

1.2.6.2加氯化鈉使最終含量為0.9%（g/ml）。

1.2.6.3加三氯甲烷使最終含量為0.5%（ml/ml）或硫柳汞液使最終含量為0.01%(g/ml)為防腐劑。用于制造凍干抗毒素者只用三氯甲烷為防腐劑。

1.2.6.4調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0。

1.2.6.5除菌過濾，并做無菌試驗。

1.2.7凍干

經(jīng)除菌過濾及半成品檢定合格的精制抗毒素，可用凍干法制成干燥制品。

1.3對制造工藝的要求及規(guī)定

1.3.1制造室內(nèi)部裝修材料應(yīng)便于清潔消毒，地面耐腐蝕，室內(nèi)盡可能低溫，力爭做到無菌操作。

1.3.2所用儀表和量具應(yīng)精密準確，并經(jīng)常校正。一切與血漿接觸的器皿、用具等，應(yīng)注意不染有熱原質(zhì)，不含有毒物物質(zhì)。消化液加熱處理前后的器皿、用具須嚴格處理。未經(jīng)處理的器皿、用具不得用于不同批。

1.3.3所用化學原料的規(guī)格應(yīng)不低于化學純（三級純）或符合《中國生物制品主要原材料試行標準》規(guī)定。胃酶應(yīng)力求活力高，粘液素含量少，類A血型物質(zhì)含量低，并經(jīng)過活力單位及類A血型物質(zhì)含量測定。制造用水，應(yīng)采取有效措施防止污染或產(chǎn)生熱原質(zhì)。

1.3.4抗毒素精制的每步操作均應(yīng)盡量除凈非抗毒素蛋白質(zhì)，以提高制品純度。

1.3.5制造過程中加酸、堿及硫酸銨等時，速度不宜過快，避免局部濃度過高；酸、堿原液嘗試不宜超過2mol/L。操作時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生大量泡沫。應(yīng)采取有效措施防止染菌和產(chǎn)生熱原質(zhì)。除必要的操作時間外，應(yīng)盡量縮短生產(chǎn)周期。

1.3.6制造過程中必須嚴格執(zhí)行《生物制品分批規(guī)程》，不得將中間回收品并入不同批內(nèi)。制造批號不同但制造方法與所含防腐劑相同并經(jīng)檢定（無菌試驗、安全試驗、熱原質(zhì)試驗）合格的半成品可進行合并，但合并批數(shù)不得超過2批。多價制品，其各單價半成品合并時，亦應(yīng)符合上述原則。

1.3.7關(guān)于精制抗毒素再制的規(guī)定

1.3.7.1凡屬下列范圍的半成品及成品，可予再制。

（1）熱原質(zhì)試驗結(jié)果陽性者。

（2）非肉眼可見而通過無菌試驗發(fā)現(xiàn)的染菌，經(jīng)過濾不能除菌者。

（3）理化檢定不合格者。

（4）成品裝量不足者。

（5）超過效期的庫存制品。

（6）種類及制造方法相同，批號及數(shù)量清楚的分裝檢損品及濾器沖洗液可合并再制（但該批再制品的分裝檢損品應(yīng)予廢棄）。

1.3.7.2再制方法可根據(jù)具體情況制定，但制成后的質(zhì)量必須符合檢定要求。

1.3.8多價氣性壞疽抗毒素按下列單位比例進行混合。

威氏：水腫：膿毒=2∶2∶1。

必要時可加入1份溶組織抗毒素。

1.3.9制成之精制抗毒素，須在冷暗處保存至少1個月作為穩(wěn)定期。

1.4半成品檢定

由制造部門進行理化檢定、無菌試驗、安全試驗、熱原質(zhì)試驗、類A血型物質(zhì)測定及效價測定。效價測定、類A血型物質(zhì)測定及熱原質(zhì)試驗可與質(zhì)量檢定部門會同進行。檢定方法及要求同成品檢定。

2　成品檢定

由質(zhì)量檢定部門進行全面檢定，半成品已會同檢定的項目可抽檢。

2.1鑒別試驗

每批成品至少抽取一瓶作以下鑒別試驗：

2.1.1作動物中和試驗（同效價測定）或免疫擴散試驗，以驗證本品系瓶簽標示的抗毒素。

2.1.2用兔抗馬血漿的兔Igg　與本品作免疫擴散試驗，以驗證本品為馬血清蛋白成分（如同一制造室無其他動物免疫血清生產(chǎn)，本試驗可免做）。

2.2理化檢定

2.2.1外觀

液體精制抗毒素應(yīng)為幾乎無色或淡黃色的澄明液體，不得含有渣?；虍愇铮L期貯存后可有微量能搖散的沉淀產(chǎn)生。除血清本身及防腐劑的特有氣味外，不得有其他氣味。凍干精制抗毒素應(yīng)為白色或微帶粉紅色的疏松體，加入規(guī)定量蒸餾水后輕輕搖動，應(yīng)于15分鐘內(nèi)完全溶解。溶解后的外觀應(yīng)與液體精制抗毒素相同。

2.2.2固體總量及蛋白含量

液體精制抗毒素以及凍干制品的安規(guī)定量溶解后，固體總量不得超過20%（g/ml）。蛋白含量不得超過17%（g/ml）。

2.2.3pH值應(yīng)為6.0～7.0。

2.2.4氯化鈉含量應(yīng)為0.85%～0.95%(g/ml)。

2.2.5硫酸銨含量

液體精制抗毒素以及凍干制品按規(guī)定量溶解后，均不得超過0.1%（g/ml）。

2.2.6液體精制抗毒素的防腐劑，用三氯甲烷者不得超過0.5%（mlg/ml），用硫柳汞者不得超過0.01%（g/ml）。

2.2.7凍干精制抗毒素水分含量不得超過3%。

2.2.8電泳檢查

將樣品稀釋至2%蛋白濃度，做瓊脂糖電泳分析，應(yīng)不含或僅含痕量白蛋白遷移率的蛋白。

2.2.9F（ab）2含量

用SDS-PAGE法（見《生物制品化學檢定規(guī)程》）測定，預(yù)防用抗毒素的F（ab）2含量不得低于50%，治療用抗毒素的F（ab）2含量不得低于60%。

2.3無菌試驗

按《生物制品無菌試驗規(guī)程》進行。

2.4安全試驗

取體重300～400g豚鼠2只，每只皮下注射精制抗毒素5ml，于第3至5日觀察局部，除輕度紅腫外，應(yīng)無膿腫及壞死；第7日局部反應(yīng)應(yīng)消失，且體重不輕于注射前，如體重有輕微下降，可繼續(xù)觀察3日，如體重上升且高于注射前，可判為合格。

2.5熱原質(zhì)試驗

按《生物制品熱原質(zhì)試驗規(guī)程》進行，注射劑量為3ml/kg。判定標準按該4.1項要求進行。

2.6類A血型物質(zhì)含量。

用血凝抑制法（附錄6）測定，類A血型物質(zhì)不得超過4μg/ml。

2.7效價測定

2.7.1效價測定用標準抗毒素及試驗毒素由中國藥品生物制品檢定所統(tǒng)一定期分發(fā)。

2.7.2各種抗毒素的效價測定分別按附錄2～5進行。

2.7.3對各種抗毒素成品（凍干制品系按規(guī)定溶解后）的最低效價要求如下：

抗毒素種類IU/ml　IU/gp

白喉預(yù)防用：2000　30000

治療用：3000　40000

破傷風預(yù)防用：2000　35000

治療用：3000　45000

氣性壞疽（多價）1000

氣性壞疽（威氏）1000　8000

氣性壞疽（膿毒）1500　12500

氣性壞疽（水腫）2500　20000

氣性壞疽（溶組織）2500　20000

A型肉毒3000　20000

B型肉毒3000　20000

E型肉毒3000　20000

3　保存

應(yīng)保存在2～8℃冷暗干燥處。

4　效期

自效價測定合格之日起，精制抗毒素裝20%（不得低于16%）超量者，液體制品效期為5年，凍干制品效期為7年；裝10%（不得低于8%）超量者，液體制品效期為3年，凍干制品效期為5年。