《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基礎(chǔ)》 二、限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease），又簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。它們的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為從基因組中分離目的基因提供了必要的手段.限制酶能特異地識(shí)別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分離出來。

限制酶主要來源于原核生物，是一組能水解DNA磷酸二酯鍵的酶。迄今已發(fā)現(xiàn)的限制酶多達(dá)數(shù)百種，分為三類。在基因工程中使用的主要是第二類。限制酶根據(jù)其來源命名。例如，限制酶EcoRⅠ來源于大桿菌E.coli的RY13菌株,Ⅰ指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。

下面是一些最常用的限制酶的來源及其識(shí)別順序(表13-1)

每種限制酶識(shí)別和切割的通常為4-6個(gè)核苷酸序列,稱為限制性位點(diǎn)(restriction sites)或切點(diǎn).限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產(chǎn)生的末端也有兩種：第一種是交錯(cuò)切割，即兩條鏈的切點(diǎn)不在同一水平而是相隔數(shù)個(gè)堿基，故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補(bǔ)的單鏈，這種末端容易互補(bǔ)連接，稱為粘性末端（cohesive terminus）；第二種為平整切割，即兩

表13-1 常用的限制酶的來源及其識(shí)別順序列

名稱識(shí)別序列來源AvaC↓(C/T)CG(A/G)GAnabaena variabilisBam HG↓GATCCBacillus amyloliquefaciens HBgl ⅡA↓GATCTBacillus globigiiEco RⅠG↓(*/A)ATTCEscherichia coliRY13Eco RⅡ↓CC(A/T)GGEscherichia coliR245HaeⅢGG↓(*/C)CHaemophilus aegyptiusHindⅢ(*/A)↓AGCTTHemophilus influenzae RdHpaⅠGTT↓AACHaemophilus parainfluenzaeHpaⅡC↓(*/C)GG同上KpnⅠGGTAC↓CKlebsiella pneumoniaeMboⅠ↓GATCMoraxella bovisPstⅠCTGCA↓GProvidencia stuartii

*被甲基化

條鏈在同一水平切開，得到平齊末端（blunt terminus）(圖13－2)。由于具有相同粘性

圖13－2 限制酶的兩類切割方式

末端的DNA片段在DNA連接酶的作用下很容易共價(jià)連接，因此被廣泛地應(yīng)用于重組DNA操作中。具有相同平齊末端的DNA片段也可以連接，但連接效率只有粘性末端連接效率的1％。

限制酶的上述特性在基因工程和基因診斷中具有重要用途：①首先不論DNA的來源如何，用同一種內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的粘性末端很容易重新連接，因此很容易將人和細(xì)菌或人和質(zhì)粒任何兩個(gè)DNA片段連接在一起，即重新組合，這是重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)。②人類的基因組很大，不切割無法分析其中的基因。限制酶能把基因組在特異的部位切開，即切割不是隨機(jī)的，因而從每個(gè)細(xì)胞的基因組得到的是相同的一組長(zhǎng)度各異的片段。這些可能含有某一基因的片段可用電泳分離，并加以研究。③由于限制酶的特異性，如果識(shí)別位點(diǎn)的堿基發(fā)生了改變，限制酶將不再能切割；同樣，堿基的改變也可能導(dǎo)致出現(xiàn)新的酸切位點(diǎn)。在人類基因組中，這兩種情況是十分常見的，而切點(diǎn)的消失或出現(xiàn)將影響獲得的DNA片段的長(zhǎng)度，表現(xiàn)為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP），這在基因的連鎖診斷中具有極重要的意義。